研究背景:细菌和真菌感染引发的疾病仍然是人类日常生活中最常见的、危害最大的一类疾病,随着各类抗菌类药物的大量及长时间交叉使用、临床治疗中的广泛且不合理用药以及致病菌种类的不断增加,导致菌类感染的疾病不断加剧,细菌、真菌的耐药性也不断升级。目前,国内外对于细菌及真菌类感染性疾病的治疗手段仍然以抗生素治疗为主,但临床上常见的致病菌种对于常用抗菌药物已经普遍具有耐药性。现如今面临着致病菌产生耐药性的速度在不断加快,而新型抗菌药物的研发却越来越慢。为了研究开发出更多更高效的抗菌药物,世界各国每年都会在抗菌药物的研发方面投入大量的人力、财力和物力,但收效却不显著。开发新型抗菌药物仍然是当今世界面临和亟待解决的难题。近年来,伴随着中医药现代化研究技术的不断发展,中药在抗菌方面的研究也取得了较大的进展。中药用于疾病防治已有几千年历史,具有多组分、多靶点和多作用的特点,临床研究及众多经方、验方都表明,清热解毒和清热燥湿类中药多具有抗菌活性。研究表明,结合致病菌的感染方式,机体免疫力低下及新陈代谢较低的人群更容易受到菌种的侵袭而染病,在临床治疗中,医生常会开具一定的维生素B、C补充剂要求患者服用。因此,增加自身机体免疫力无疑是抗菌的重要一环。本文依托具有诸多抗菌优势的中药有效成分,通过化学合成的手段将维生素类化合物与有效抗菌成分进行优势拼合,拟开发一种具有抗菌活性的新型药物,为抗菌药物的研发提供一定的研究思路。研究目的:本研究从原料出发对绿原酸结构进行修饰,提高其稳定性和脂水分配系数,合成绿原酸类似物,再基于药物的拼合原理,将维生素B族的烟酰胺引入到绿原酸类似物的结构中,合成一种全新的目标化合物(NACA-I),之后再对其进行体外抑菌活性评价和毒性评价,旨在评估目标化合物是否具有高效低毒的优势,并对其抑菌机理进行初步探究,为后续对目标化合物的进一步研究和剂型开发提供参考。研究内容:(1)基于合成绿原酸的现有研究成果和药物化学的拼合原理,以组成绿原酸的两部分—奎尼酸和咖啡酸为起始原料,经邻位羟基的保护、奎尼酸5位羟基的氧化及还原氨基化、咖啡酸的酰氯化、5位羟基氨基化的奎尼酸与咖啡酸酰氯的缩合反应,合成一种将绿原酸结构中的酯键替换为酰胺键的新型绿原酸类似物,除酰胺键外保留绿原酸其他的结构特征;之后将新型绿原酸类似物的1位羧基与烟酰胺进行拼合,合成最终的目标化合物。通过IR、1H-NMR、13C-NMR、HRMS元素分析等波谱学方法对合成的化合物进行结构鉴定。(2)对新合成的目标化合物进行体外抑菌活性研究,采用滤纸片扩散法,通过抑菌圈直径的考察来评价目标化合物对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌效果,以绿原酸供试液、烟酰胺供试液、绿原酸和烟酰胺的混合供试液作为对照;采用微量稀释法来测定目标化合物对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),以及绘制对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的时间杀灭曲线,综合评价其是否具有快速高效的抑菌效果。(3)对新合成的目标化合物进行体外细胞毒性试验,来初步评估其安全浓度阈值。采用CCK-8试剂通过检测目标化合物作用于L-02人正常肝细胞后的OD值变化,并与对照组相比较,综合评价目标化合物的细胞毒性,筛选出目标化合物的安全浓度范围。(4)在确定目标化合物具有较好抑菌活性前提下对其进行抑菌机理的初步探究,通过电导率仪检测菌体电解质,考马斯亮蓝试剂盒检测菌体蛋白质,碱性磷酸酶(AKP)试剂盒检测相关酶,借助酶标仪和扫描电镜等对目标化合物的抑菌机理进行研究,为后续研究提供一定的参考数据。研究结果:(1)成功合成预期的目标化合物,并对其结构进行初步鉴定以及对合成过程中的多个关键中间体结构进行了鉴定。(2)通过滤纸片扩散试验发现,当目标化合物的供试液浓度为40 mg·mL-1时,敏感性评价结果为对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌在极度敏感的范围,对耐药型金黄色葡萄球菌属于低度敏感。当目标化合物供试液的浓度稀释到20 mg·mL-1时,其对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌作用后抑菌圈直径均大于15 mm小于20 mm,敏感性评价结果为该浓度下对这两种菌呈高度敏感,对耐药型金黄色葡萄球菌仍然属于低度敏感。将目标化合物供试液一直稀释到浓度为1.25 mg·mL-1时,对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌仍表现为低度敏感性,而此时对耐药金黄色葡萄球菌无抑菌作用。通过微量稀释法测得目标化合物对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为40 μg·mL-1和160 μg·mL-1。对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的MBC值分别为160μg·mL-1和320 μgm·L-1。通过时间杀灭曲线证明目标化合物具有快速高效的杀菌优势。(3)细胞毒性结果表明,当目标化合物NACA-I浓度在5～40 μg·mL-1范围内时,对L-02人正常肝细胞的增殖有促进作用,且在浓度为40 μg·mL-1时,细胞存活率最大,当目标化合物NACA-I浓度在80～320 μg·mL-1范围内时可能对L-02肝细胞存在一定毒性。如果仅以L-02肝细胞存活率来确定目标化合物NACA-I相关活性的安全浓度时,其最佳浓度为40～160μg·mL-1。(4)目标化合物对白色念珠菌抑菌机理初步研究表明,其发挥抗菌作用可能是通过破坏菌体的细胞壁和细胞膜系统,使细胞壁凹陷破裂,细胞膜通透性增加,从而影响白色念珠菌的正常生物功能。研究结论:在对绿原酸结构缺陷进行修饰后,再引入烟酰胺不仅使目标化合物整体更加稳定,而且其抑菌活性明显提高,具有快速高效的杀菌优势,目标化合物的细胞毒性与未进行结构改造前相近,对其抑菌机理也进行了初步探究,达到了本研究预期目的,为后续的进一步研究及新型抗菌药物的研发方向提供了一定的参考价值。