富含γ-氨基丁酸辣木叶发酵液的制备及其抗炎活性研究

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辣木是一种具有多种功能活性价值的热带及亚热带植物,营养丰富,富含蛋白质,维生素及多种活性成分。γ-氨基丁酸(GABA)是辣木特征活性成分之一,是辣木降血压、抗病毒、抗炎等功效活性的主要功能因子。本论文以辣木叶为原料,利用植物乳杆菌LK-1发酵提高辣木叶水提物中的γ-氨基丁酸的含量,研究发酵过程中营养成分、风味成分、抗氧化活性的变化,并系统评估辣木叶发酵液的抗炎活性。本研究可为开发一种富含γ-氨基丁酸的辣木发酵饮品提供了理论依据和技术指导。1、发酵菌种的筛选及富含γ-氨基丁酸的辣木叶发酵条件的确定。通过对4个菌株发酵辣木叶产GABA量进行对比试验,选定植物乳杆菌LK-1为发酵菌株。随后对辣木叶添加量、谷氨酸钠添加量、初始pH、发酵温度、发酵时间等五个因素,进行单因素和正交试验,以GABA含量为指标确定最佳发酵条件:辣木叶添加量4%,MSG添加量4 g/L、初始pH值6.5、发酵温度35℃、发酵时间72 h。在此条件下发酵辣木叶,发酵液的GABA含量最高为209 mg/L,比未发酵的辣木叶提取液提高2.45倍(p<0.05)。2、对辣木叶发酵过程中的的营养成分(可溶性蛋白、黄酮、多酚、游离氨基酸),风味成分(有机酸、挥发性物质),抗氧化活性(DPPH清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、总抗氧化能力)的变化进行了研究。结果显示,与未发酵的辣木叶液相比,发酵72 h后的辣木叶发酵液中,多酚含量的得到显著的提升,提高约24%(p<0.05),黄酮、可溶性蛋白、总游离氨基酸含量有不同程度的下降,分别下降24%、47%、27.5%(p<0.05);辣木叶发酵液的风味物质发生了很大的变化,乳酸、芳樟醇、2-庚酮、3-己烯-1-醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-戊酮、2-甲基丙醇、乙偶姻成为主要风味物质;总抗氧化能力及超氧阴离子清除能力得到显著提高,分别提高42%和68%(p<0.05)。羟自由基清除能力和DPPH清除能力分别下降2%和48%,但其清除率仍在60%和40%以上。3、通过ELISA,RT-PCR,Western Blot检测细胞中各类炎症介质的表达,系统的研究了辣木叶发酵液的抗炎机理。采用MTT法检测辣木叶发酵液细胞毒性,显示辣木发酵液浓度在1000μg/mL以下时,对细胞并无明显的毒性作用。ELISA试验表明浓度在1251000μg/mL的辣木叶发酵液能不同程度的抑制M1型促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的分泌水平(p<0.05),最大抑制率分别为35.33%、83.5%、77.44%和43.3%,以及增强M2型抗炎因子IL-10的分泌水平(p<0.05),最大提升率为76.1%。这表明辣木叶发酵液能够通过抑制M1型促炎因子以及增强M2型抗炎因子的含量来达到抗炎的作用。RT-PCR试验表明浓度在125500μg/mL的辣木叶发酵液能有效抑制M1型促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB以及促进M2型抗炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达,这与酶联免疫反应法测定炎症因子分泌水平结果基本吻合。此外,辣木叶发酵液能有效地抑制PEG2、TLR4的mRNA表达,这表明辣木叶发酵液可能通过TLR-s/NF-KB通路调节炎症反应。Western Blot试验表明浓度在125500μg/mL的辣木叶水提物发酵液能够下调M1型促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的蛋白表达量,以及上调M2型抗炎因子IL-10的表达量,这与上述ELISA及RT-PCR结果基本一致。
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