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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的DNA分子约为130 Kbp,含有150多个开放阅读框,是已知昆虫病毒中研究最多且应用广泛的一种杆状病毒。昆虫杆状病毒具有杀虫率高,不产生抗药性,宿主特异性高,对人畜安全,不污染环境,不易造成生态平衡的破坏等特点,是新型生物农药的代表。蝎为了生存和防卫的需要在体内表达一系列毒素蛋白,这些毒素蛋白可特异结合并调控可兴奋细胞膜上的离子通道。其中,蝎昆虫神经毒素(insect-selective scorpion neurotoxin)只作用于于昆虫细胞,对哺乳动物细胞毒害小,因此广泛被用于新型重组病毒杀虫剂的研发。本课题组将从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)中克隆到的兴奋型蝎昆虫毒素基因(BmK IT)重组到AcMNPV基因组中,抗虫实验结果表明,重组杆状病毒AcMNPV-BmKIT (IE1)杀虫活能力明显显优于野生型杆状病毒,但是其抗虫分子机制尚未阐明。本研究主要分为三个部分：第一部分：重组病毒AcMNPV-BmkIT对草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡蛋白Sfp53表达的影响。克隆Sfp53基因并构建了表达质粒pRSETc-Sfp53,制备了抗体。用2.28×1012vp/mL(10MOI)的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT分别感染Sf9细胞6-45h, western blot检测细胞内凋亡蛋白Sfp53的表达水平。结果显示,病毒感染细胞12、21、27和33 h时,AcMNPV-BmK IT处理组SfP53蛋白的表达水平分别是AcMNPV处理组的4.16、3.50、4.01和2.56倍；病毒感染细胞39和45 h时,AcMNPV处理组SfP53蛋白表达水平是分别是AcMNPV-BmK IT处理组的5.30和2.91倍,即AcMNPV-BmKIT处理组SfP53蛋白表达水平急剧减少,说明AcMNPV-BmK IT在感染前期提前促进细胞SfP53蛋白的高表达,可加速细胞的凋亡进程。第二部分：重组病毒AcMNPV-BmK IT对病毒抗凋亡基因iap1、iap2、p35转录水平的影响。用2.28×1012vp/mL (10 MOI)的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT分别感染Sf9细胞6-72 h,qRT-PCR检测AcMNPV-BmK IT对抗凋亡基因iop1、iap2、p35转录水平的影响。结果显示,在感染36、48和72h时,AcMNPV-BmKIT处理组细胞内iapl基因转录水平是AcMNPV处理组的20.15、6.88和2.35倍,说明AcMNPV-BmK IT促进了iapl转录水平的升高,因该IAP1蛋白前期证明是促凋亡的功能,结果暗示iapl转录水平的升高促使细胞凋亡的能力增强,利于病毒子代包涵体的传播。AcMNPV-BmK IT感染Sf9细胞各时间点iap2基因转录水平均低于AcMNPV处理组,且感染细胞36、48和72 h时,AcMNPV处理组中iap2基因转录水平是AcMNPV-BmK IT处理组的15.22、12.00和3.70倍,说明AcMNPV-BmK IT强烈抑制了iap2基因的转录。AcMNPV-BmK IT感染Sf9细胞不同时间点p35基因转录均强于AcMNPV处理组,且感染细胞36、48和72 h时,AcMNPV-BmK IT处理组p35基因转录水平分别是AcMNPV处理组的15.47、22.94和2.61倍,说明AcMNPV-BmK IT促进了抗凋亡基因p35的转录,增强了病毒的抗凋亡能力,推测是此时细胞SfP53蛋白水平提高所致。第三部分：重组病毒AcMNPV-BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白缆索结构形成及其在核内聚集的影响。首先,用2.28×1012vp/mL(10 MOI)的AcMNPV与AcMNPV-BmKIT分别感染草地贪夜蛾Sf9细胞2h和3h,免疫荧光分析结果显示,未感染组细胞内没有肌动蛋白缆索结构的形成；在各时间点,AcMNPV-BmK IT处理组细胞内肌动蛋白缆索结构形成量低于AcMNPV处理组,说明AcMNPV-BmK IT对肌动蛋白缆索结构的形成具有削弱作用。接着,用相同病毒滴度的AcMNPV与AcMNPV-BmK IT分别感染Sf9细胞6-46h,结果显示,病毒感染细胞6-25h时,两组病毒处理的细胞内肌动蛋白于细胞内表面都形成腹面聚集体、细胞核内出现少许肌动蛋白；在感染细胞31h和37h时,AcMNPV处理组中有大量肌动蛋白向核内聚集,AcMNPV-BmK IT肌动蛋白向细胞核内聚集程度和聚集时间都远低于AcMNPV处理组；在病毒感染细胞46 h后,AcMNPV处理组肌动蛋白仍聚集在细胞核内,而AcMNPV-BmK IT处理组细胞核中的肌动蛋白大量减少,说明AcMNPV-BmK IT延缓了肌动蛋白向核内聚集并提前了肌动蛋白出核时间。Western blot检测结果与免疫荧光分析结果一致,即AcMNPV-BmK IT处理组细胞推迟了肌动蛋白向核内聚集,加快肌动蛋白出核。以上实验结果分析了AcMNPV-BmK IT侵染Sf9细胞对凋亡相关基因和细胞肌动蛋白重排的影响及作用机制,为重组病毒杀虫剂的研发及机制分析提供了实验依据。