牙鲆早期发育经历一个典型的变态过程，其身体从两侧对称变成两侧不对称，外形上最大的变化是右眼移到身体的左侧。同时，其背鳍、骨骼肌、胃腺、红细胞等在细胞和分子水平上也发生明显变化。甲状腺素在这些变化中起到核心的调控作用。除甲状腺素外，碱性磷酸酶(ALP)也是脊椎动物发育中的一个关键因子，参与多种生理活动，特别是骨骼的发育。ALP与甲状腺素关系密切，已经有实验证明人肠ALP是由甲状腺素受体直接调控的靶基因。为探讨ALP在牙鲆仔鱼发育中的功能、基因表达及其与甲状腺素的关系，本文采用组织学、分子生物学和生物信息学的方法对牙鲆ALP进行了比较系统的研究。 1、牙鲆ALP表达图式与消化道发育 原肠期胚体中即可以检测到ALP的活性，位于胚体的周围区域，无明显的分节现象，卵黄中始终没有酶活性。出膜后，在头和背部的分布比较多，而在身体的中部内脏区域，分布较少。出膜后的仔鱼至进食后，ALP开始在消化道中大量的表达，特别是在胃肠道粘膜层。 消化道作为ALP分布最集中的部位，不仅是一个消化吸收器官，也是一个免疫和内分泌的器官。本文首先对其发育进行了组织学观察。出膜后3天内，消化道不断延长并且和卵黄共存，肠开始分化。卵黄也越来越小，第5天卵黄基本消失，肝脏初步发育，位于肠的上方。出膜后15天，变态发育开始，消化道已经分化为口、咽、食道、胃前体、肠和后肠。胰脏位于肠的环绕中。杯状细胞在消化道大多数部位都有分布。5-羟色氨细胞、胃泌素细胞和P物质细胞三种内分泌细胞很少且形状不规则。第30天，消化道分化完全，胃上皮发育成柱状上皮，杯状细胞减少，可见胃腺，标志胃成熟。胃盲囊也出现。内分泌细胞在胃肠中增多，但个体间存在一定的差异。第50天，幼鱼消化道发育比较成熟，管壁的结构完整，三种内分泌细胞分布部位出现分化，幼鱼的肝脏和胰脏仍在进一步发育。牙鲆消化道和高等脊椎动物类似，分为食道、胃、胃盲囊和肠。肠也可分为前肠、中肠和后肠。三者之间没有明显的界限。胃和前肠是消化吸收主要的区域。胃盲囊和前肠结构和功能非常类似。5.羟色氨细胞和P物质细胞在牙鲆胃前部的粘膜中零星分布，在胃体中较多见，平均每10<4>μm<2>胃体粘膜上皮约各有2.2和2.0个阳性细胞。而胃泌素细胞分布在胃盲囊和前肠中，平均每10<4>μm<2>粘膜上皮分别有0.98个和0.71个阳性细胞。 2、LP cDNA全长克隆与ALP序列分析 牙鲆ALP cDNA全长为1811bp，预测能编码476个氨基酸的蛋白质，分子量为52293.1Da，等电点为7.67。编码区核苷酸GC含量在ALP同源基因中差异比较大，脊椎动物明显高于非脊椎动物和细菌。由蛋白序列构建的分子系统树显示，牙鲆ALP和青黑斑河豚(Tetraodon，nigroviridis)、斑马鱼(Danio rerio)的组织非特异性ALP有较高的同源性，分子进化树和物种进化树是一致的。在蛋白序列中的一些重要的功能位点，包括金属离子结合位点、N糖基化位点和丝氨酸磷酸化位点等表现了较高的保守性。 本研究从Swiss-prot等数据库中共搜集385条ALP蛋白质序列。古细菌有6种，原核生物有228种，真核生物有151种。整个序列库中ALP蛋白序列平均长度为514.5个氨基酸。原核的序列要短于平均序列长度，为499.3个氨基酸，其中最短的为287个氨基酸，最长的为844个氨基酸。而古细菌和真核生物的长度接近，为536.5个氨基酸，真核生物比原核的平均长度要长且表现了更宽的变化范围，提示可能是由于酶进化过程中基因重复产生或丢失次要部分而产生较大的多态性，是真核生物的酶为发挥更精细的功能的需要。选取2S条ALP基因编码区偏好使用的密码子有18个均为G和C结尾。仅有Phe的同义密码子没有偏好性。 将通过折叠子预测方法构建的牙鲆和产甲烷菌ALP 3D结构和人PALP、大肠杆菌ALP 3D结构比较后发现，其结构的核心区仍然保持较高的相似性，其中位于两个Zn离子和一个Mg离子周围的14个关键氨基酸中仅有4个位点表现了多态性。这些位点可能对于酶的活性差异产生重要的影响。而比较四种ALP的半胱氨酸空间位置后发现，牙鲆ALP中可能只存在一个二硫键，产甲烷菌中可能没有二硫键。人PALP、大肠杆菌的半胱氨酸空间位置差距较大，没有表现出同源性。 3、牙鲆发育中ALP的功能及其与甲状腺素关系 变态前的仔鱼身体总ALP活力约为出膜前后的卵中酶活力的4倍，在变态期酶活力变化不大，但是在变态后期上升明显。T4在变态中前期对酶活力有明显的促进作用。TU和TRM均能降低仔鱼体内酶活力。TRM处理组的仔鱼消化功能和头部骨骼的发育受到一定的影响，消化道内食物很少，消化道上皮层中ALP免疫显色反应减弱；头部骨骼中发现较多骨细胞死亡而只留下一些细胞碎片；超过95％的仔鱼不能完成右眼的移位就发生死亡，变态比较迟缓。 采用RT-PCR和定量PCR的方法在牙鲆卵到出膜后5天的时候不能检测到ALP基因表达，到变态前期的仔鱼体内开始表达。在胃、肝、鳃、皮肤、皮下肌肉、肾中均能检测到ALP基因的表达。变态中期表达量只有初期的1/2，变态后期却明显上升到初期的2．5倍，T4和TU处理对ALP表达产生的影响在中期和后期表现明显。中期T4组明显高与对照组和TU组，变态后期T4组和TU组均低于对照组。TRαA和TRαB在变态中均有一个高峰时期，但前者在变态后期下降，后者则依然保持一定的水平。TRβ表达量变化范围最大，不同药物处理产生的结果差异也很明显。外源性的T4和T4合成抑制剂TU对ALP的活性和基因表达均产生较大的影响，结果表明T4对ALP存在调控的关系。 牙鲆ALP基因启动子区的950bp经过软件预测的转录起始位点位于翻译起始密码予ATG上游127位A，没有典型的TATA框。比较牙鲆、人、黑猩猩、小鼠、斑马鱼和鸡ALP基因启动子区对应的950个碱基序列相似性接近50％。系统进化分析和使用cDNA的系统分析结果类似。