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心血管生理及病理生理与昼夜节律生物钟关系密切,生物钟基因Bmal1（脑和肌肉ARNT样蛋白1）通过调节代谢、氧化还原平衡、免疫反应、血管的收缩和舒张等各种生物学反应而参与心血管疾病的发生发展过程。高血脂、高血糖、吸烟等心血管危险因素通过诱发血管内皮细胞和平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）氧化应激和炎症反应而导致血管损伤和心血管疾病。研究表明,炎症反应和氧化应激均受生物钟基因Bmal1的调节。Bmal1及其二聚化伴侣蛋白Clock形成异二聚体,结合于DNA的E-box元件上调节活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成相关基因和炎症因子基因表达。活性氧产生和炎症反应是心血管疾病发生发展的关键因素。氧化应激（oxidative stress）是指体内氧化系统与抗氧化系统失衡的一种状态,低水平的ROS是细胞发挥正常功能所必须的,但在心血管疾病危险因素作用下,ROS产生与清除之间的平衡被打破,过量的ROS被形成。高水平的ROS对蛋白质、脂质和DNA造成过氧化损伤,成为导致衰老和心血管疾病的一个重要原因。VSMC是血管壁的主要细胞部分,它们通过收缩改变血管管径和张力而调节血压,根据内外环境变化的需要维持心血管稳态。氧化应激通过引起血管内皮损伤继而使VSMC发生一系列生物学改变。VSMC结构和功能的异常是心血管疾病,包括动脉粥样硬化、动脉瘤以及衰老等相关疾病的危险因素之一。Bmal1在控制分子时钟中起着关键作用,其表达异常可导致生物节律的紊乱。生物钟和应激刺激（例如激素、氧化应激和组织的局部微环境）一起影响细胞特异性基因的昼夜表达节律。这些刺激可以直接或通过调节转录因子的表达和活性而调控靶基因的节律性表达。近年来,虽然生物钟基因在心血管疾病发生发展中的作用及分子机制的研究引起人们的关注并取得很大进展,但Bmal1在VSMC氧化应激反应中的作用及机制尚未完全阐明。本研究用H2O2触发VSMC氧化应激反应,研究Bmal1在VSMC氧化应激反应中的作用及机制,为深入认识昼夜节律系统与氧化应激相关心血管疾病之间的关系提供新思路。目的:探究Bmal1在VSMC氧化应激反应中的作用及相关机制。方法:1.用100μmol/L H2O2处理VSMC不同时间,ROS荧光染色和免疫印迹分析检查H2O2对NOX1和p47表达及ROS形成的影响;2.用H2O2处理VSMC不同时间后,实时荧光定量PCR、免疫印迹分析检测H2O2对Bmal1和HO-1表达的影响;3.用si-Bmal1在VSMC中敲低Bmal1表达后,免疫荧光、免疫印迹、实时荧光定量PCR分析Bmal1敲低对NOX1和p47表达及ROS水平的影响;4.用Ad-Bmal1转染VSMC后,免疫印迹分析VSMC中Nrf2和HO-1的表达水平;5.通过结扎小鼠颈动脉建立血管内膜增生模型,将成年雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、颈动脉结扎+si-NC转染组、颈动脉结扎+si-Bmal1组,14天后取材,采用HE染色、免疫荧光、免疫组化分析Bmal1敲低对血管内膜增生及氧化应激反应的影响。结果:1.H2O2通过上调NADPH氧化酶NOX1和p47亚基在VSMC中的表达而促进ROS产生MTS结果显示,100μmol/L H2O2作用于VSMC 48 h对细胞没有明显的毒性。在VSMC被100μmol/L H2O2刺激6、48 h后,ROS荧光探针染色结果显示,H2O2处理VSMC可使ROS水平显著升高;同时,H2O2刺激显著诱导NOX1和p47表达,提示H2O2通过上调NOX1和p47表达而促进ROS形成。2.H2O2刺激VSMC导致Bmal1和HO-1表达下调q RT-PCR及免疫印迹分析结果显示,在H2O2处理的VSMC中,Bmal1和ROS清除酶HO-1表达水平随时间延长呈下降趋势,且两者变化趋势相一致。3.Bmal1下调通过阻抑Nrf2和HO-1表达而增加ROS形成为了明确Bmal1在VSMC氧化应激反应中的作用及机制,我们用si-Bmal1敲低Bmal1在VSMC中的表达后检查H2O2对氧化应激的影响。q RT-PCR及免疫印迹分析结果显示,Bmal1下调使Nrf2及受其调控的抗氧化因子HO-1表达水平下降,NADPH氧化酶NOX1和p47亚基表达水平上升;同时伴随着ROS水平升高。4.Bmal1过表达可逆转H2O2对Nrf2和HO-1表达的下调用Ad-Bmal1转染VSMC,免疫印迹分析检查Bmal1过表达对Nrf2和HO-1表达的影响。结果显示,Bmal1过表达显著增加Nrf2和HO-1表达水平,逆转H2O2对Nrf2和HO-1表达的下调。5.Bmal1敲低通过诱导氧化应激反应促进颈动脉结扎诱导的血管内膜增生。为了验证上述实验结果的生理病理学意义,我们通过结扎小鼠颈动脉制备血管内膜增生模型。在结扎血管的同时,原位转染si-Bmal1,14天后取材观察血管形态学变化。HE染色结果显示,结扎14天后,与未结扎的颈动脉血管相比,结扎血管的内膜增生明显,用si-Bmal1敲低Bmal1后,血管内膜增生进一步增加。免疫组化及ROS荧光探针染色结果显示,结扎14天后,与未结扎血管相比,被结扎的血管中ROS形成及NADPH氧化酶NOX1、p47亚基表达水平显著上升,与转染si-NC的血管相比,用si-Bmal1敲低Bmal1表达后,ROS形成及NOX1、p47亚基的表达水平进一步升高。结论:1.H2O2通过上调NADPH氧化酶NOX1和p47亚基在VSMC中的表达而促进ROS形成。2.H2O2刺激VSMC可导致Bmal1和HO-1表达下调。3.Bmal1下调通过阻抑Nrf2和HO-1表达而增加ROS形成。4.Bmal1过表达可逆转H2O2对抗氧化基因Nrf2和HO-1表达的下调。5.Bmal1敲低通过诱导氧化应激反应促进颈动脉结扎诱导的血管内膜增生。