论文部分内容阅读
目的:观察大鼠体外循环（Cardiopulmonary bypass,CPB）下心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）中琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）的变化,明确缺血后处理（Ischemic postconditioning,IPO）减轻大鼠MIRI,与SDH、线粒体ATP敏感性钾通道(Mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel,mitoKATPC)的关系和作用,明确大鼠IPO心肌保护机制中SDH与mitoKATPC的关系。方法:160只成年雄性SD大鼠,体重300-350g。建立成年大鼠CPB缺血再灌注及IPO模型。随机分为8组,每组20只:正常组（Nor）、SDH竞争性抑制剂丙二酸二甲酯（Dimethyl malonate,dm）对照组（dm+Nor）、缺血再灌注组（I/R）、dm+缺血再灌注组（dm+I/R）、缺血后处理组（IPO）、dm+缺血后处理组（dm+IPO）、mitoKATPC特异性抑制剂5-羟基癸酸（5-Hydroxydecanoate,5-HD）+缺血后处理组（5-HD+IPO）、dm+5-HD+缺血后处理组（dm+5-HD+IPO）。Nor组大鼠CPB转机160分钟后结束实验;I/R组行CPB转机10分钟后,关闭主动脉并造成大鼠全心停跳30分钟,开放主动脉转机复灌120分钟,结束实验;IPO组在I/R组的基础上,于转机复灌前,对主动脉予以30s开放和30s关闭,重复3次,最后开放主动脉转机复灌117分钟后结束实验;dm+I/R组、dm+IPO组和dm+5-HD+IPO组均于全心停跳前10分钟开始泵注dm 4mg/kg·min-1,持续40min,直至复灌开始,dm+Nor组在对应时间段泵注dm,其余各组在对应时间段泵注等体积生理盐水;5-HD+IPO组和dm+5-HD+IPO组于IPO前5min注射5-HD5mg/kg,其余各组在对应时间注射等体积生理盐水。术中持续监护生命体征。于复灌末,采血并摘取大鼠心脏进行如下检测:1.制备心肌2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色标本,测量心肌梗死面积（Infarct size,IS）并计算百分比（IS%）;2.制备心肌电子染色标本,于透射电镜下观察心肌超微结构,并计算心肌细胞线粒体Flameng评分;3.通过ELISA法测定血浆肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-MB,CK-MB）和肌钙蛋白I（Cardiac troponin I,cTnI）浓度;4.制备心肌免疫荧光染色标本,于激光共聚焦显微镜下评估活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）生成;5.吸光度法测定心肌组织中SDH活性,以及琥珀酸（Succinic acid,SA）和延胡索酸（Fumaric acid,FA）的含量;6.通过RT-qPCR和Western-blotting技术测定心肌组织琥珀酸脱氢酶黄素蛋白（Succinate dehydrogenase flavoprotein,SDHA）的mRNA和蛋白表达。结果:1.心肌IS%的变化:I/R组IS%较Nor组明显增大（P<0.05）;而dm+I/R组和IPO组IS%较I/R组获得了较好改善（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组IS%有所降低（P<0.05）,5-HD+IPO组IS%增大（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。2.心肌超微结构改变和线粒体Flameng评分的变化。2.1心肌超微结构改变:Nor组和dm+Nor组心肌超微结构基本正常;I/R、5-HD+IPO组和dm+5-HD+IPO组心肌超微结构出现明显破坏,以I/R组最为明显;IPO组和dm+I/R组优于I/R组,但较dm+IPO组损伤较重。2.2线粒体Flameng评分的变化:同Nor组相比,I/R组Flameng评分明显升高（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组Flameng评分降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组Flameng评分降低（P<0.05）,5-HD+IPO组Flameng评分升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。3.血浆CK-MB&cTnI浓度的变化:同Nor组相比,I/R组CK-MB&cTnI明显升高（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组CK-MB&cTnI降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组CK-MB&cTnI降低（P<0.05）,5-HD+IPO组CK-MB&cTnI升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。4.心肌ROS含量的变化:同Nor组相比,I/R组ROS含量增加（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组ROS含量减少（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组ROS含量减少（P<0.05）,5-HD+IPO组ROS含量增加（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5心肌SDH活性,SA和FA含量的变化。5.1心肌SDH活性的变化:同Nor组相比,I/R组SDH活性升高（P<0.05）,dm+Nor组SDH活性下降（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组SDH活性降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组SDH活性降低（P<0.05）,5-HD+IPO组SDH活性升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5.2心肌SA含量的变化:Nor组SA含量高于dm+Nor组（P<0.05）,但明显低于I/R组（P<0.05）;dm+I/R组和IPO组较I/R组SA含量降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组SA含量降低（P<0.05）,5-HD+IPO组SA含量升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5.3心肌FA含量的变化:同Nor组相比,I/R组FA含量降低（P<0.05）,dm+Nor组FA含量升高（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组FA含量升高（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组FA含量升高（P<0.05）,5-HD+IPO组FA含量降低（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。6.心肌SDHA mRNA和蛋白质表达量的变化:Nor组SDHA表达量高于dm+Nor组（P<0.05）,但明显低于I/R组（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组表达量降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组表达量降低（P<0.05）,5-HD+IPO组表达量升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。结论:1.心肌缺血再灌注促进琥珀酸脱氢酶黄素蛋白的表达,使琥珀酸脱氢酶活性增加,导致心肌缺血再灌注损伤。2.应用琥珀酸脱氢酶抑制剂丙二酸二甲酯抑制琥珀酸脱氢酶活性,可有效减轻心肌缺血再灌注损伤。3.缺血后处理可以减轻大鼠体外循环下心肌缺血再灌注损伤,其机制与开放线粒体ATP敏感性钾通道及抑制琥珀酸脱氢酶的活性有关,且缺血后处理对琥珀酸脱氢酶的抑制作用是通过开放线粒体ATP敏感性钾通道实现的。