目的：本实验拟利用核酸免疫的原理,构建含有目的基因肝特异性F蛋白的核酸质粒,并对其在体内外的表达以及免疫后体内的免疫反应进行研究,以确定构建真核表达质粒本身的质量及其引起的免疫反应,为后续研究奠定基础。1.pcDNA3.1-F质粒在COS-7细胞中的表达作为核酸免疫的真核表达质粒pcDNA3.1-F是以pcDNA3.1(+)为构建载体,插入可以表达出相应蛋白的目的基因,并加入促进表达的Kozak序列。目的蛋白的表达是核酸免疫起作用的前提,为验证其是否表达,本实验拟将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,在蛋白质水平观察插入目的基因的表达情况。2.pcDNA3.1-F质粒的体内表达及能否引起特异性免疫反应体外可以表达的重组质粒注射入小鼠体内后,是否也可以顺利的进入小鼠体细胞并得以表达是核酸免疫引起机体免疫反应的前提。核酸免疫可以引起机体全面的免疫反应,包括体液免疫和细胞免疫。本实验使用真核表达质粒pcDNA3.1-F免疫,我们设想其至少可以引起机体内的体液免疫产生抗肝特异性F蛋白的抗体。为了验证这一设想,我们一方面用pcDNA3.1-F免疫小鼠制备抗血清,一方面用原核表达的方法制备肝特异性F蛋白抗原,然后用间接酶联免疫方法检测血清中特异性抗体的水平。方法：核酸免疫是近年来发展起来的一种新型免疫方法,核酸免疫不但能诱导机体产生体液免疫反应,更重要的是能诱导机体产生较强的细胞免疫反应,它不需要制备大量抗原,只需将编码抗原的cDNA克隆到真核表达载体上,用重组质粒对动物进行免疫,免疫动物即可产生针对该抗原的抗体。本研究利用核酸免疫的原理1.用PCR的方法从重组质粒PET-15b-F中扩增出肝特异性F蛋白基因,并在引物的设计中加入了Kozak序列,将克隆基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)同时进行双酶切后连接,构建真核表达质粒pcDNA3.1-F,并对其进行双酶切及测序鉴定是否构建准确。2.将构建准确的真核表达质粒pcDNA3.1-F及空质粒pcDNA3.1,瞬时转染COS-7细胞,并用Western-blot检测其表达产物。3.将Balb/c小鼠分为四组,生理盐水注射组、空质粒pcDNA3.1(+)、质粒pcDNA3.1-F、质粒pcDNA3.1-F+F蛋白(第四次免疫),质粒提取均为纯化去内毒素,按照分组分别肌肉注射免疫Balb/c小鼠,每隔两周免疫一次,连续免疫四次,每次免疫前断尾取血制备抗血清,用间接酶联免疫方法对收集血清进行检测。结果：1.用PCR的方法从重组质粒PET-15b-F中扩增肝特异性F蛋白基因,与预期的F蛋白基因大小相符,F片段和空质粒pcDNA3.1(+)双酶切后连接,经酶切及测序鉴定肝特异性F蛋白表达质粒pcDNA3.1-F构建准确。2.将构建准确的真核表达质粒pcDNA3.1-F及空载体pcDNA3.1(+),瞬时脂质转染COS-7细胞,Western-blot检测,实验结果表明只有转染pcDNA3.1-F质粒的COS-7细胞中有肝特异性F蛋白的表达。3.间接酶联免疫方法检测各组抗体效价,生理盐水组和空质粒pcDNA 3.1 (+)组实验结果证实无相关抗体的检出,而免疫pcDNA3.1-F的小鼠获得了特异性抗体。结果表明：pcDNA3.1-F质粒能够在动物体内表达,在肌肉注射免疫小鼠后,可以引起机体产生特异性的肝特异性F蛋白抗体。但在第四次免疫注射原核表达的肝特异性F蛋白组抗体效果水平明显高于重组质粒注射组,可见质粒免疫抗体效价并不高,还有待进一步的对核酸免疫的各个环节进行优化。结论：已通过酶切鉴定和测序分析,pcDNA3.1-F构建准确,Western-blot证明了蛋白在细胞中正确表达,免疫小鼠也同样获得了特异性抗体,说明pcDNA3.1-F质粒能够在动物体内表达,并且F蛋白编码基因具有良好的免疫原性。为后续的肝特异性F蛋白单克隆抗体的制备及其免疫试剂的研制开发做好了前期的铺垫。但要想得到高表达量的特异性抗体还需要对表达载体、免疫过程等方面进一步优化。