RNA重塑蛋白主要分为RNA解旋酶和RNA分子伴侣两大类,这些蛋白能够结合并重塑RNA二级结构或者通过RNA-蛋白相互作用,参与几乎所有的RNA生物学反应。对于病毒来说,尽管有许多在功能上已经被预测或者鉴定的病毒编码的RNA解旋酶及RNA分子伴侣,但是这些病毒编码的RNA重塑蛋白在体外的功能和在病毒复制周期内重要的生物学作用尚未研究清楚。小RNA病毒科(Picornaviridae)包括许多重要的感染人类及其他哺乳动物的病毒,其中的肠道病毒属(genus Enterovirus)包括脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)以及柯萨奇病毒(coxsackievirus)等重要的人类病原。在脊髓灰质炎病毒在全球绝大部分地区被免疫接种而根除以后,EV71因能感染导致幼儿罹患手足口病,引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等症状,严重的还能导致患儿死亡,同时又缺乏有效的疫苗和针对性药物,而成为危害人类健康最重要的病毒之一。EV71基因组由一条大的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)编码一个多聚蛋白,两端有非编码区5’UTR和3’UTR组成,多聚蛋白经过剪切形成4个结构蛋白VP1～4和7个非结构蛋白2A-3D。其中,2C蛋白在小RNA病毒中最保守,具有解旋酶超家族SF3(superfamily 3)的所有保守结构域,具有ATP酶活性,在病毒复制中起重要作用,但是2C最重要的解旋酶活性却一直未曾被确定及报道。因此,小RNA病毒非结构蛋白2C的解旋酶活性很值得我们深入研究。通过对EV712C蛋白的三维结构进行预测与模拟,并与已知的其他SF3超家族解旋酶结构比较,我们发现2C蛋白的解旋酶核心区域与SF3解旋酶核心区域高度重合。进一步研究通过真核表达EV712C蛋白,发现该2C蛋白能够解旋两端突出的RNA-RNA双链,而且2C的解旋活性对底物没有特异性,也能够解旋两端都有RNA单链突出的RNA-DNA杂合链,两端都有DNA单链突出的DNA-DNA双链和DNA-RNA杂合链。另外,2C的解旋活性不具有方向性,能够从3’或5’端解旋RNA双链,但对平末端双链底物则不能解旋。进一步深入研究各种生化条件对2C蛋白解旋活性的影响,我们发现2C能够不依赖于ATP的方式解旋RNA双链,但是ATP能够促进2C的解旋,而没有任何NTP存在、或抑制2C的ATPase活性的条件下,2C仍具有较弱的解旋活性。同时,2C也能够不依赖于二价金属阳离子而解旋,但是低浓度的Mg2+能够促进2C解旋,高浓度的Mg2+反而会抑制2C的解旋活性。更进一步研究发现,ATP及Mg2+能够促进2C以3’→5’的方向性对RNA双链解旋,这种性质符合典型的3’→5’RNA解旋酶活性,与其他已知的SF3解旋酶一致；同时,2C也能够以不依赖于ATP和Mg2+的方式解旋,而该解旋活性不具有方向性,这又属于典型的RNA分子伴侣活性。因此,我们认为2C同时具有3’→5’RNA解旋酶活性和RNA分子伴侣活性,通过对其他肠道病毒2C蛋白的研究发现,2C蛋白的这种活性在肠道病毒中是保守存在的。对EV712C的RNA分子伴侣活性研究发现,2C的RNA分子伴侣活性能够以浓度依赖和时间依赖的方式促进两条具有发卡结构的RNA互补双链退火,而且还能够促进依赖复杂的RNA结构发挥功能的核酶(ribozyme)的剪切活性。深入研究发现,在2C的三个主要结构域中,C末端结构域(C-terminal domain,CTD)本身不具有分子伴侣活性,但是当2C失去CTD结构域时,该蛋白就失去了RNA分子伴侣活性,从而证明CTD对2C的分子伴侣活性是必需的。为了阐明2C蛋白的RNA重塑活性在病毒核酸复制过程中的作用,我们还利用EV71复制酶蛋白3D进行了体外EV71 RNA复制实验。通过该研究我们发现2C能够以提高病毒RNA模板链利用率的方式促进RNA复制。在复制过程中,一方面,2C能够解旋复制中间产物(RNA双链)；另一方面,2C还能促进RNA引物退火到RNA模板上,开始新一轮复制,从而在复制过程中提高模板利用效率。从病毒学角度,通过转染感染性EV71 RNA以及病毒拯救实验发现,2C的解旋酶活性缺失导致病毒RNA在细胞内无法复制,以及病毒粒子无法包装成熟。因此,2C具有完整解析活性对病毒复制具有重要意义。本研究在体外首次实验证明了小RNA病毒EV712C的解旋酶活性,又发现该蛋白还具有RNA分子伴侣活性。这是第一次发现这两种RNA重塑活性能同时为一个蛋白所具有,丰富了我们对RNA重塑蛋白的认识。同时,在体外以及细胞内验证了2C能够协助小RNA病毒复制,是病毒RNA复制不可或缺的一部分,为2C在小RNA病毒复制中的重要作用提供新的依据。因此,本工作对于研究RNA重塑蛋白的解旋酶活性和分子伴侣活性、以及病毒编码的RNA重塑活性在病毒复制周期中的功能机制具有十分重要的理论意义,对揭示人类肠道病毒以及小RNA病毒的核酸复制机制也具有重要意义。