诱导移植器官供体特异性免疫耐受是器官移植长期的研究目标。尽管动物实验中已能诱导成功的耐受模型，但临床实用的耐受诱导方法则难以突破。Starzl等提出了嵌合体的理论推动了供体骨髓细胞(DBMC)输注促进嵌合体形成，提高移植器官长期存活的临床研究。但是，DBMC输注诱导免疫耐受的确切机制至今仍不清楚，而且在器官移植同时输注DBMC可以引起一系列冲突的免疫效应，除了可能使受体对供体致敏外，输注的DBMC还可能对受体起免疫反应，即可能诱发移植物抗宿主病(GVHD)； 2003年浙江大学博士学位论文③DBMC中复杂的细胞成分可能调节供体细胞对受体的反应；③最有意义的是：输注的DBMC可能抑制受体对供体抗原的免疫反应。Ma thew等通过一系列的体外培养实验来观察DBMC的作用，发现：首先DBMC具有对异体抗原细胞免疫反应的调节作用，即免疫抑制作用，并呈现剂量依赖性，而且DBMC发挥免疫调节作用必须依靠细胞直接接触的信号传导；必需是有活力的细胞而非灭活的细胞才能起作用；其次，DBMC能作为反应细胞，对异基因抗原的刺激起反应。但低剂量的免疫抑制剂对这种DBMC 的自发免疫作用有效。同时低剂量的免疫抑制剂对DBMC作为调节细胞时的免疫调节作用没有阻断作用，因此说明临床DBMC可能会引起GVHD的风险（但因为受体的自身免疫系统和造血系统未清除，所以这种GVHD的风险将降到最低）；此外在免疫抑制剂存在的下；DBMC的调节免疫反应的能力并不受到抑制，因此DBMC 的临床应用是 实用的；再者，DBMC具有免疫原性，但是明显弱于供体脾脏来源 细胞的免疫原性。但一旦清除反应细胞中的抗原递呈细胞，则反 应细胞对DBMC的反应能力被抑制，而且在免疫抑制剂存在条件 下，反应细胞对DBMC的反应能力能被抑制，并呈现剂量依赖性。 国内外其他研究组对DBMC诱导免疫耐受的细胞成分的作用则鲜 有研究。而 CD34 阳性干细胞是骨髓有别于其他供体来源耐受诱 导细胞的重要成份，CD34阳性于细胞具有多分化潜能和自我复制 的能力，因此DBMC输注后受者体内的嵌合细胞可能就是CD34阳 性干细胞起源分化的产物；CD 34阳性干细胞高表达HLA－DR而低 表达共刺激分子B卜1，B7刁的特点，使其成为”天然”诱导免疫耐 受的细胞，因此对DBMC中CD34阳性干细胞的直接免疫调节作用 进行研究，将有助于揭示DBMC输注诱导免疫耐受的机制，并对临 床实用的免疫耐受诱导途径提供新的思路。目前国内对DBMC中 CD34阳性干细胞的直接免疫调节作用还没有研究，国外研究也刚 起步，本课题拟与国外同步进行实验，对CD34 阳性干细胞的直 接免疫调节作用，及其剂量，供体特异性以及临床常用免疫抑制 4 2003年浙江人学博士学位论文剂组合对其的影响进行研究。 材料与方法1．体外培养细胞的分离 提取尸体供器官的脾脏和骨髓中的单个核细胞，液氮冻存。2．骨髓CD34造血干细胞的分离 应用MACS磁珠分选系统和CD34阳性细胞分选试剂盒阳性选择，富集CD34阳性干细胞；并应用流式细胞仪对其表型进行分析。3．骨髓来源细胞对单向混合淋巴细胞反应（MLR）的调节作用 取血型相合，HLA－11类抗原不匹配的脾淋巴细胞分别作为反应细胞与刺激细胞，以相应的未处理的骨髓单个核细胞、CD34阳性细胞和CD34阴性细胞作为调节细胞；建立体外MLR体系，观察DBMC及各细胞组分的免疫调节作用与是否有供体特异性。4．不同免疫抑制剂组合对CD34干细胞单向MLR的影响 观察临床常用免疫抑制剂组合：高剂量环抱素问SA）＋霉酚酸MPA）、低剂量环抱素（CSA）＋霉酚酸（MPA）、他克莫司（FKS 06）＋霉酚酸（MPA）、高剂量环抱素（CSA）＋霉酚酸（MPA）cD乃单克隆抗体对不同剂量CD34阳性干细胞免疫调节作用的影响。5．观察MLR上清中细胞因子的变化 留取代表性组的MLR上清，ELISA法检坝 几一、2、IL－10、MCP－1和TGF－ pl表达的变化。 6．统计学方法 所有实验数据经 SPSS．0软件进行统计学处理，P＜0．口5判定有统计 学差异。 结 果 通过 CD34 磁珠分选，CD34 阳性细胞从未分离前的 1．670l 039％（1．2狐“2．21们，富集到88．6％is．盼（84．7％－N．狐）。分选的CD34阳 5 2003 ie浙江大学博士学位论文性细胞 98．6％i 2．1％表达肌A－DR，而几乎不表达 CD80和 CD86（阳性率分S］I为 1．02％LO。15％和 1．35?