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全国肿瘤登记中心通过分析全国肿瘤发病与死亡资料,估计2015年全国肝癌相关死亡率在恶性肿瘤相关的死亡率中排名第3位,发病率在恶性肿瘤中位于第4位。尽管近年来医学研究、医疗设备和医疗技术取得了很大的进步,但目前临床上缺乏治疗肝癌的有效方法。多数肝癌患者晚期会出现大量恶性腹腔积液(malignant ascites,MA),大量腹腔积液严重影响患者的生存质量?目前没有治疗恶性腹腔积液十分有效的方案。目前的研究认为血管渗透性增加和新生血管的形成是MA形成的主要机制。研究者认为拮抗血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶的作用可以减少MA的形成?但这些药物的临床疗效有限,仍需寻找其他有效的治疗手段。肝癌的发生、发展过程中多条信号通路起着重要的作用。目前的研究认为在肝癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织和细胞中信号转导与转录激活因子家族(signal transduction and activators of transcription,STATs)的重要成员STAT3异常表达和激活,STAT3参与了肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡过程。免疫细胞及免疫因子参与了肝癌发生、发展的各个环节。白介素(IL)-9是Th9、Th17等多种免疫细胞分泌的免疫效应因子。IL-9通过与IL-9受体结合发挥生物学作用。目前的研究发现IL-9具有多种免疫效用,它即存在促炎作用又存在抗炎作用。但目前IL-9在肿瘤中的研究较少,IL-9与肿瘤的关系尚未明确。研究发现使用IL-9干预黑色素瘤细胞,可抑制细胞的生长。相反的是,在肺癌的研究发现IL-9能促进肺癌细胞的增殖。我们在前期的研究中发肝癌并恶性腹腔积液患者MA中Th9细胞比例以及IL-9浓度高于对应外周血水平,也高于肝硬化患者腹水中的水平。且相关性分析发现MA中Th9细胞比例以及IL-9水平与患者的生存时间呈负相关关系。那么Th9/IL-9对肝癌细胞的生物学行为存在怎样的影响呢?Th9/IL-9是通过何种机制对肝癌细胞产生影响的呢?Th9/IL-9是否可以作为肝癌恶性腹腔积液干预治疗的靶点呢?为探索上述问题我们将从以下两方面进行研究:第一部分白介素-9对肝癌细胞的生物学作用及其机制研究目的:研究白介素(IL)-9干预后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的改变情况,并探索IL-9对肝癌细胞生物学行为生产影响的可能机制。方法:体外培养SMMC-7721细胞至对数生长期,将SMMC-7721细胞分成实验组和对照组,实验组分别予12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的重组人IL-9处理,对照组不予任何干预。干预细胞24h后,CCK8法检测肿瘤细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。留取培养基上清ELISA检测上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平。提取细胞RNA后RT-PCR检测MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。提取细胞蛋白后Western-blot法检测细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表达水平。在探索IL-9对SMMC-7721细胞产生影响的机制的研究中,实验组分别予50ng/mL IL-9、50 ng/mL IL-9+40umol/L AG490处理,对照组不做任何处理。干预细胞24h后,CCK8法检测肿瘤细胞增殖情况;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。Western-blot法检测细胞中STAT3和p-STAT3表达水平,RT-PCR检测MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。结果:以12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL浓度的IL-9干预SMMC-7721细胞24 h后,SMMC-7721细胞增殖率明显上升,与此同时SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力亦增加(p<0.05),且IL-9对SMMC-7721细胞增殖和转移能力的促进作用随着IL-9浓度的增高而增强。但在凋亡实验中并未发现IL-9干预SMMC-7721细胞后,细胞的凋亡率发生明显改变(p>0.05)。对培养基上清进行ELISA检测后发现,与对照组相比,实验组在IL-9干预后上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平显著升高(p<0.05)。RT-PCR检测结果亦显示,与对照组相比,实验组细胞在IL-9干预后细胞中MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表达水平升高(p<0.05)。与对照组比较,IL-9干预后SMMC-7721细胞中的JAK2、STAT3蛋白水平无明显改变(p>0.05),但p-JAK2、p-STAT3表达水平显著增高(p<0.05)。使用AG490预处理后,IL-9对SMMC-7721的增殖和转移的促进作用被削弱(p<0.05),且p-STAT3、MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表达水平亦显著降低(p<0.05)。结论:IL-9以浓度依赖性促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,但对细胞凋亡无显著影响。IL-9对肝癌细胞生物学行为的促进作用是通过激活STAT3磷酸化,促进MMP-2,MMP-9和VEGF表达实现的。第二部分抗IL-9抗体对肝癌恶性腹水抑制作用的实验研究目的:检测肝癌恶性腹腔积液小鼠模型外周血和恶性腹腔积液中IL-9、IFN-γ浓度,检测肝癌恶性腹腔积液小鼠模型脾脏中Th9、Th1细胞比率。探索腹腔注射抗IL-9抗体治疗肝癌恶性腹腔积液的疗效及作用机制。方法:取传代第7天H22肝癌腹水小鼠1只,吸取小鼠腹腔乳白色瘤液后,用生理盐水将细胞悬液浓度调整为1×10~7/mL。然后将0.2 ml(相当于瘤细胞数2×10~6/只)肿瘤细胞悬液注射到每只小鼠腹腔内,制备H22肝癌腹水小鼠模型。造模2周后ELISA检测模型小鼠腹水和外周血中IL-9、IFN-γ浓度,流式细胞术检测其脾脏中Th9、Th1细胞比例。然后于造模24h后将60只小鼠随机分成三组,即空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组给予腹腔注射生理盐水,阴性对照组给予腹腔注射同型IgG抗体,实验组给予腹腔注射抗IL-9抗体,隔天一次,共注射5次。每次注射前均称量各组小鼠体重,测小鼠腹围,并观察小鼠日常活动状态。末次用药结束24h后每组处死5只小鼠,测量MA体积,收集MA上清采用ELISA法检测MA中VEGF?IL-9、IFN-γ表达水平。留取小鼠脾脏,分离脾脏中淋巴细胞,采用刺激阻断剂预处理4个小时后,进行表面CD4抗原染色,然后破膜进行胞内IL-9,IFN-γ染色,染色后流式细胞术检测脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例。末次用药结束24h后每组取5只小鼠,每只小鼠予静脉注射浓度为50 mg/ml的伊文蓝各0.2 ml,注射2h后收集腹水,离心后留取上清,然后用酶标仪检测腹水上清的吸光度值。其余小鼠观察其生存时间。结果:与正常对照组小鼠对比,H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ浓度升高,脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例升高,差异有统计学意义(p<0.05);干预后实验组、阴性对照组和空白对照组小鼠MA的体积分别为(8.44±1.13)mL、(10.88±1.35)mL、(10.56±2.10)mL,与照组相比实验组小鼠MA的体积显著减少,差异有统计学意义(p<0.05)。实验组小鼠中位生存时间为18天(17-20天),显著长于阴性对照组14天(13-17天)和空白对照组14天(13-16天),Log-rank检验显示与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠生存时间显著延长,差异有统计学意义(p<0.05);与阴性对照组和空白对照组相比,实验组H22肝癌腹水小鼠腹水上清中VEGF、IL-9水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),但3组间IFN-γ水平比较差异无统计学意义(p>0.05)。三组小鼠腹水上清的平均吸光度值为1.82±0.14,1.78±0.08和1.25±0.09,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠腹水中伊文蓝浓度显著下降(p<0.05)。流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组小鼠给予抗IL-9抗体治疗后脾脏中Th9细胞和Th1细胞比例下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ浓度升高,脾脏中Th9细胞、Th1细胞比例升高;腹腔注射抗IL-9抗体治疗可能通过降低体内IL-9水平,减少Th9细胞形成,促使肿瘤细胞表达VEGF下降从而减轻H22肝癌腹水小鼠的腹膜血管渗透性,减少腹水的形成,延长H22肝癌腹水小鼠的存活时间。