论文部分内容阅读
在中国,乳腺癌已位居于女性恶性肿瘤发病首位,严重威胁着中国女性的健康。在临床上,三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)由于其雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、及人表皮生长因子2(human epidermal receptor 2,Her2)表达均为阴性,因此对于内分泌治疗和分子靶向药物赫赛汀治疗无效,缺乏针对性的有效治疗。TNBC的治疗目前是乳腺癌治疗领域的热点及难点之一。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene l,BRCA1)是与乳腺癌密切相关的抑癌基因。BRCA1的缺失可导致乳腺癌的发生发展。大量研究证实BRCA1基因突变,抑制BRCA1基因表达,从而导致乳腺癌的发生发展,且与家族性乳腺癌密切相关。但在散发性乳腺癌中,BRCA1基因的序列是完整的,却检测到其m RNA和蛋白表达水平明显减少,说明影响BRCA1基因表达水平的机制,除BRCA1基因突变,还有其他机制导致BRCA1基因表达减低。目前的研究认为基因异常甲基化在正常细胞发生恶性转变以及在恶性肿瘤的侵袭性逐渐增强的过程中占有重要的作用。且有研究发现TNBC中BRCA1基因甲基化率较高。目的:探讨三阴性乳腺癌中乳腺癌易感基因BRCA1启动子和第一外显子异常甲基化与其表达之间的关系。进而为三阴性乳腺癌的治疗开辟新思路。方法:1应用免疫组织化学方法检测不同分子分型的乳腺癌组织中BRCA1蛋白的表达。2应用实时荧光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR)检测不同分子分型乳腺癌细胞中BRCA1 m RNA表达水平。3应用实时荧光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR)检测不同分子分型乳腺癌细胞中药物对BRCA1 m RNA表达的影响。4应用免疫细胞化学方法检测不同分子分型乳腺癌细胞中BRCA1蛋白的表达水平。5应用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分别检测不同分子分型乳腺癌细胞中BRCA1启动子和第一外显子Cp G岛甲基化水平。结果:1不同分子分型的乳腺癌组织中BRCA1蛋白表达水平组织芯片免疫组织化学结果显示(见图1、2)(见表1):TNBC BRCA1蛋白表达率57.9%(11/19);Luminal型乳腺癌BRCA1蛋白表达率85.5%(59/69)和HER2+型乳腺癌BRCA1蛋白表达率76.9%(10/13)。TNBC组BRCA1蛋白表达率低于Luminal组有统计学意义(P<0.05);TNBC组BRCA1蛋白表达率低于HER2+组,但差异无统计学意义(P>0.05);HER2+型组BRCA1蛋白表达率低于Luminal型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。2不同分子分型乳腺癌患者的生存分析不同分子分型的乳腺癌患者生存分析结果显示(见图3)(见表2):三种分型乳腺癌患者总生存有差异(P<0.05)。其中TNBC组和HER2+型组患者与Luminal组相比总生存期明显缩短,有统计学差异(P<0.05);TNBC组患者与HER2+型组相比总生存期无统计学差异(P>0.05)。3 BRCA1蛋白表达阳性和阴性乳腺癌患者的生存分析BRCA1蛋白表达阳性和阴性乳腺癌患者的生存分析结果显示(见图4)(见表2):BRCA1蛋白表达阴性患者与BRCA1蛋白表达阳性患者相比总生存期缩短,差异无统计学意义(P>0.05)。4不同分子分型的乳腺癌细胞中BRCA1 m RNA的表达水平应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、MDA-MB-453中BRCA1 m RNA表达水平。BRCA1m RNA的表达水平通常用2-△△CT值来表示。结果显示(见图5):MDA-MB-231、BT549、MCF-7、MDA-MB-453细胞中BRCA1 m RNA表达水平分别为1.00±0.08、1.11±0.14、2.42±0.21、5.89±0.65。三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231与TNBC细胞BT549 BRCA1 m RNA表达无统计学差异;TNBC细胞MDA-MB-231和BT549 BRCA1 m RNA表达均小于Luminal型乳腺癌细胞MCF-7和HER2+型乳腺癌细胞MDA-MB-453,有统计学意义(P<0.001);Luminal型乳腺癌细胞MCF-7细胞BRCA1 m RNA的表达小于HER2+型乳腺癌细胞MDA-MB-453,有统计学意义(P<0.001)。5去甲基化药物(5-Aza-DC)对不同分子分型的乳腺癌细胞BRCA1m RNA表达水平的影响。乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、MDA-MB-453分别经1mmol/L 5-Aza-DC、2mmol/L 5-Aza-DC处理72h后,通过RT-q PCR检测BRCA1 m RNA表达水平。结果显示(见图6):MDA-MB-231细胞:1mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平为(1.94±0.24),2mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平为(2.35±0.66),均与未加药组(1.00±0.08)相比显著增高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。BT-549细胞:1mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平(1.22±0.08)与未加药组(1.01±0.13)差别无统计学意义,2mmol/L5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平(2.69±0.34)与未加药组相比显著增高,差异有统计学意义(P<0.01)。MCF-7细胞:1mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平(1.15±0.19)与未加药组(1.00±0.09)差别无统计学意义,2mmol/L5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平(1.42±0.18)与未加药组相比显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。MDA-MB-453细胞:1mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平为(3.18±0.70),2mmol/L 5-Aza-DC处理组BRCA1 m RNA的表达水平为(5.97±0.87),均与未加药组(1.00±0.11)相比显著增高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。6不同分子分型的乳腺癌细胞中BRCA1蛋白的表达水平本实验应用免疫细胞化学的方法检测四种乳腺癌细胞中BRCA1蛋白水平。BRCA1蛋白免疫细胞化学阳性信号均呈棕黄色,即存在于细胞质中也存在于细胞核中。结果显示(见图7):TNBC细胞MDA-MB-231、BT549中BRCA1蛋白表达水平均低于Luminal型乳腺癌细胞MCF-7和HER2+型乳腺癌细胞MDA-MB-453。这与BRCA1 m RNA表达结果一致。7不同分子分型的乳腺癌细胞中BRCA1启动子甲基化率本实验应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测乳腺癌细胞BRCA1启动子(-908~-714)甲基化率。结果显示(见图14、15):MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、MDA-MB-453细胞系甲基化率分别是(26/180)14.44%、(7/180)3.89%、(4/180)2.22%、(2/180)1.11%。与BRCA1 m RNA、蛋白表达负相关。8不同分子分型的乳腺癌细胞中BRCA1第一外显子甲基化率本实验应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测乳腺癌细胞BRCA1第一外显子(-70~165)甲基化率。结果显示(见图14、15):MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、MDA-MB-453细胞系甲基化率分别是(6/182)3.30%、(1/182)0.55%、(13/182)7.14%、(0/180)0.00%。与BRCA1 m RNA、蛋白表达无相关性。结论:1三阴性乳腺癌中BRCA1基因表达较Luminal型和HER2+型表达低,且与BRCA1启动子(-908~-714)的甲基化率呈负相关。2三阴性乳腺癌中BRCA1第一外显子(-70~165)的甲基化率与BRCA1基因表达无关。