研究背景:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是终末分化阶段B细胞的一种血液系统恶性肿瘤,以恶性浆细胞克隆性增殖为特征。克隆性浆细胞分泌大量单克隆免疫球蛋白(monoclonal protein,M蛋白),导致终末器官的损害引起临床症状。尽管当前治疗手段的发展对MM疗效有了很大的改善,但目前MM仍是不可治愈的血液系统恶性肿瘤,MM发生发展的机制尚待深入挖掘。浆细胞遭受感染、炎症的刺激后,会产生DNA损伤和基因组不稳定性,可以通过出现和积累遗传学事件,逐渐发展成为有临床症状的MM。随着疾病的进展,新的细胞遗传学事件不断出现,染色体易位、基因拷贝数变异和体细胞单核苷酸变异等事件的积累促进了 MM的克隆演变。遗传事件的出现与MM细胞(multiple myeloma cells,MMCs)的基因组不稳定性密切相关,DNA损伤后的修复异常是直接原因。DNA损伤中,最严重的是DNA双链断裂(double strand break,DSB),主要由细胞通过同源重组(homologous recombination,HR)以及非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)这两种方式修复DSB。而MM的生存离不开骨髓微环境,特别是其中的巨噬细胞(macrophages,MΦs)与MM发生发展密切相关,本课题组前期研究亦表明MΦs对MMCs的生存、增殖、耐药等有着重要的促进作用。基于MM的高异质性和基因组不稳定性的特征,以及MΦ>s对MMCs的保护作用的研究基础,本研究欲进一步阐明MΦs是否影响MMCs DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)和DNA修复,寻找MΦs与MMCs的基因组不稳定性的关系及其机制。研究目的:1.探究MΦs(macrophages,MΦs)与患者细胞遗传学FISH结果的关系。2.体外培养MΦs并鉴定其表型,明确MΦs在MMCs基因组不稳定时的作用。3.探究体外及体内动物模型中MΦs对MMCs DDR和DNA修复的影响,并阐明HR、NHEJ具体修复方式在其中所起的作用。研究方法:1.免疫组织化学检测患者骨髓活检标本中CD68的含量。2.流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测体外培养的MΦs CD80,CD86,CD163和CD206的表达,鉴定其表型。3.体外实验主要分为MMCs单独培养组和MΦs共培养组;体内实验观察MMCs组与MΦs瘤内注射组的结果差异。4.流式细胞术检测同MΦs共培养前后的ARP-1,OPM2,MM.1S和CAG(四种MM细胞株)分别在BTZ,MPL,DEX药物作用下引起的凋亡;FCM检测MΦs共培养与否对这四种MMCs细胞周期的影响。5.Western blot检测MΦs共培养与否对MMCs中yH2AX和Rad51表达的影响。6.免疫荧光分别检测对照和MΦs组体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MMCs中γH2AX的表达,用高内涵细胞成像系统AI识别并计算细胞数和γH2AX焦点数。7.彗星实验检测体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MΦs存在与否对MMCs DNA损伤的情况,用CASP软件读取彗星图案并计算损伤DNA的含量。8.用装载SCR报告系统的U2OS-HR细胞检测HR修复水平;用装载vGEJ报告系统的U2OS-NHEJ细胞检测NHEJ修复水平。9.gRNA CRISPR/Cas9方法在HEK293T细胞中分别筛选AAVS1和HBB位点高效工作的gRNA,诱导AAVS1和HBB定点DSB,用于检测染色体易位;并筛选出高效工作的paired gRNA和CRISPR/Cas9方法检测体外及体内小鼠皮下肿瘤组织MMCs内源AAVS1和HBB位点DNA切割造成DSB,采用二代测序(next generation sequencing,NGS)并分析DNA接口处的序列,检测对照组和MΦs组MMCs NHEJ的水平和NHEJ修复的精准度及碱基丢失的情况。研究结果1.患者骨髓MΦs含量越高,FISH结果阳性率越高,特别在IgH易位、D13S319位点缺失和RB1缺失中,MΦs含量与其阳性率有相关性。其中,MΦs含量2级和3级的患者IgH易位阳性率均高于1级患者(48.1%vs 86.7%,P=0.014;48.1%vs83.3%,P=0.017);MΦs含量3级的患者D13S319缺失阳性率高于1级患者(37.0%Vs 72.2%,P=0.021)。以上5个FISH结果中,≥3个指标阳性的患者认为是复杂遗传学异常。结果显示MΦs含量分别为1级,2级和3级的复杂遗传学异常阳性率分别为37.0%,46.7%和72.2%,其中MΦs含量3级复杂遗传学异常阳性率高于1级组,卡方检验结果有显著性统计学意义(P=0.021)。2.流式细胞术检测体外用M-CSF诱导的MΦs,CD163和CD206表达较高,偏M2型。MΦs减少ARP-1,ΦPM2,MM.1S和CAG这四种MMCs由BTZ,MPL,DEX引起的凋亡。3.Western blot结果显示MΦs减少MMCs基线水平的γH2AX。博来霉素引起MMCs DSB后,MΦs仍能减少MMCs的γH2AX。分别在在2h,4h,8h,16h,24h等时间检测MMCs的γH2AX,Western blot和免疫荧光共同阐明MΦs加快MMCs的DDR。4.彗星实验再次证明MΦs促进MMCs DNA修复,减少损伤DNA的含量。辐照后4h,ARP-1,MM.1S和CAG细胞单独培养及与MΦs共培养的的损伤DNA含量分别为7.03%±2.25%vs 2.14%±0.84%,P=0.0019;30.9%±12.79%vs 4.12%±6.04%,P=0.0029;10.4%±2.75%vs 1.46%±0.38%%,P<0.001。5.在装载SCR reporter(HR报告系统)的U2OS-HR细胞中检测HR修复水平,MΦs无明显增加U2OS-HR的HR水平。Western blot检测结果显示MΦs促进MMCs表达Rad51(HR相关蛋白);流式检测细胞周期显示MΦs促进MMCs G2/期(HR修复活跃的周期)。6.在装载vGEJ reporter的U2OS-NHEJ细胞中检测NHEJ修复水平。结果显示MΦs分隔培养组的NHEJ水平高于对照组(34.4%±0.31%vs 37.03±0.18%,P<0.001)。为进一步检测MMCs内源基因NHEJ修复水平,构建paired gRNA-CRISPR/Cas9方法,选择AAVS1和HBB作为检测基因,用HEK293T细胞筛选高效工作的配对gRNA。对MMCs的AAVS1和HBB相应位点定点切割后,NGS测序NHEJ接口附近250bp左右的碱基序列。结果显示,MΦs共培养组显著增加了NHEJ的效率(AAVS1 位点:1.51±0.25 vs 1.82±0.32,P=0.024;HBB位点:1.81±0.44 vs 2.25±0.82,P=0.014),而减少了精准NHEJ修复的比例(AAVS1位点:73.34%±9.30%vs 68.57%±7.62%,P=0.016;HBB位点:37.31%±8.91%vs 32.15%±8.12%,P=0.046)。进一步分析碱基序列丢失长度,MΦs共培养组碱基丢失>3bp的概率高于单独培养组(AAVS1位点:48.72%vs 50.86%,P<0.001;HBB位点:14.47%vs 21.22%,P<0.001)。并且,在HBB位点中,MΦs延长了 MMCs NHEJ中平均丢失的长度(3.73±0.08 bp vs 4.90±0.13 bp,P<0.001)。7.采用gRNA-CRISPR/Cas9技术,在AAVS1和HBB分别造成定点切割,PCR及NGS测序形成的染色体易位序列。结果显示MΦs能促进MMCs染色体易位的概率。8.利用NOD-SCID小鼠构建人源移植瘤动物模型,Westem blot、免疫荧光实验共同证明MΦs注射组的小鼠γH2AX显著低于仅辐照组(yH2AX焦点>7的细胞的比例:28.47%±3.67%vs 1 1.96%±7.04%,P<0.001)。并且,在MΦs注射组的免疫荧光片中观察到,与MΦs直接相邻的ARP-1内YH2AX焦点>7的细胞含量显著低于整个视野γH2AX焦点>7的细胞含量(11.1%±6.64%vs 6.61%±4.37%,P=0.0096)。9.NOD-SCID荷瘤小鼠肿瘤细胞彗星实验显示,辐照后注射MΦs的荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA彗星图案的尾部明显短于单纯辐照组,直接证明损伤DNA的含量少于单纯辐照组(19.55%±4.65%vs 7.59%±2.61%,P<0.001)。10.构建荷瘤NOD-SCID小鼠检测MMCs内源基因NHEJ修复动物模型,对基因编辑组(Ctr)和基因编辑组后注射MΦs组小鼠肿瘤研磨过筛经CD138磁珠分选获得ARP-1单细胞悬液,NGS测序NHEJ接口附近250bp左右的碱基序列,结果显示,MΦs组比仅基因编辑组肿瘤细胞的orrective NHEJ水平高(1.47±0.03 vs 1.65±0.08,P=0.095),但遗憾的是P值>0.05;精准修复的水平则显著低于仅基因编辑组(80.40%±3.56%vs 72.16%±1.97%,P=0.025)。并且碱基丢失>3bp的序列含量显著高于仅基因编辑组(54.12%vs 46.56%,P<0.001),平均丢失的碱基长度增加(7.78±0.39 vs 10.01±0.64,P=0.0029)。结论:1.患者骨髓MΦs含量与细胞遗传学(FISH)结果相关,MΦs含量越高,患者细胞遗传学异常越复杂。2.MΦs降低MMCs基线γH2AX,使MMCs在基因组不稳定的情况更好地生存。3.MMCs DNA在遭受严重损伤的情况下,MΦs促进MMCs DDR和DNA损伤的修复。4.MΦs促进MMCs的S期(体内)/G2期(体外),为HR修复提供更长的时间和几率,并明显减少HR修复中LTGC的比例。5.MΦs显著促进MMCs的NHEJ修复的水平,而以牺牲NHEJ修复的精准性为代价,增加MMCs NHEJ修复中碱基丢失的长度,促进MMCs的基因组不稳定性。6.人为诱导DSB的情况下,MΦs可增加MMCs染色体易位的概率。