论文部分内容阅读
骨质疏松(Osteoporosis)是指在骨形成过程中,破骨细胞增长速率大于成骨细胞的增长。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是垂体前叶嗜碱粒细胞分泌的一种激素,主要作用为促进卵泡成熟,在绝经前和绝经后女性骨代谢调节方面发挥着重要作用。研究表明,FSH水平增高与性机能减退引起的骨质疏松有密切关系,并且FSH对骨质的作用不依赖于雌激素水平的变化,阻断FSH的作用不仅能通过抑制骨的再吸收而显著减少骨的流失,而且还能促进骨的重建。在成年人和动物中,FSHR主要表达在睾丸支持细胞和卵巢粒层细胞表面,FSHR也在成熟的人破骨细胞(OC)及破骨细胞前体即单核细胞表面表达,成为阻断FSH作用的潜在靶点。据报道,FSH与骨质疏松(OP)具有密切联系,在一定范围内阻断FSH水平的升高在骨质疏松症的治疗方面已经取得了一定效果。纳米抗体作为一种新型的单域抗体具有分子量小、稳定性好、可溶性高,易与受体结合等优势从而发挥一定的生理功能。本研究的主要目的在于制备抗FSHR纳米抗体,探讨FSHR抗体对实验大鼠骨质疏松症的治疗效果,主要包括以下几部分内容:1、噬菌体展示技术从骆驼免疫抗体文库中筛选抗FSHR纳米抗体对FSHR免疫的骆驼VHH噬菌体展示文库经过3轮淘洗筛选,获得了63个阳性克隆,其中选择丰度最高的2个克隆VHH-3F9与VHH-3F19,丰度较低的一个序列VHH-3F20以及单独序列中随机的2个VHH-3F8与VHH-3F10等5个VHH基因序列,将其构建至pET22b载体,IPTG诱导蛋白表达,Ni-离子亲和色谱纯化抗体蛋白,获得了以上5个抗FSHR纳米抗体。经ELISA验证只有VHH-3F9与VHH-3F19能与FSHR结合,且VHH-3F9结合能力较高,另外4个纳米抗体不结合。从而获得了可以在上清和胞间质均表达的抗FSHR纳米抗体VHH-3F9,且浓度及纯度较高。ELISA及Western Blot检测该抗体能与FSHR特异性结合,且VHH-3F9纳米抗体具有部分体外阻断能力,测定其温度稳定性得知在37℃处理12 h仍保留70%的活性。2、制备抗FSHR骆驼多克隆抗体以原核表达纯化的fshr234蛋白为抗原,对新疆双峰驼进行免疫,每隔两周加强免疫,共免疫七次。在第七次加强免疫两周后,对骆驼进行免疫后采血,间接elisa法测定抗fshr多克隆抗体的血清效价达到128000大量收集骆驼免疫后血清,采用proteina柱子亲和纯化骆驼未免疫血清与免疫后血清,获得抗fshr骆驼多克隆抗体总igg。elisa测得骆驼抗fshr多克隆抗体igg的最低反应浓度为0.0625μg/ml。体外检测抗fshr抗体与caov-3细胞表面fshr的结合,细胞免疫化学实验结果表明vhh-3f9纳米抗体和抗fshr骆驼多克隆抗体igg与caov-3细胞表面的fshr均有结合,且多抗igg结合能力较高,vhh-3f9有部分结合能力。3、利用双侧卵巢切除建立sd大鼠骨质疏松症模型本研究中实验动物sd大鼠随机分为两组,分别是去势ovx组和对照sham组。去势后检测雌二醇(e2)、卵泡刺激素(fsh)、黄体生成素(lh)等雌激素水平以及骨密度(bmd)以评价建立的骨质疏松症动物模型。实验结果发现10周龄大鼠去势2周后,与sham组相比,ovx组e2水平显著下降(p<0.01),且在2到5周内保持平稳状态。fsh及lh水平均显著增加(p<0.05),且在2到5周内增加趋势缓慢,达到相对稳定水平。继续饲养3周,即去势8周后测定sd大鼠骨密度(bmd)水平,结果表明ovx组骨密度显著低于sham组(p<0.05),从而验证骨质疏松症模型成立。4、抗fshr抗体对sd大鼠骨质疏松症的治疗采用尾静脉注射治疗骨质疏松症sd大鼠,纳米抗体vhh-3f9以及骆驼抗fshr多克隆抗体igg,按相同剂量即2mg/kg,亮丙瑞林(le)按1.6mg/kg,对照组注射200μl的pbs。各组每周均治疗2次,共治疗6周。采血进行血清各项指标检测,观察每组对sd大鼠骨质疏松症的影响。实验结果发现,与对照sham组相比,实验组e2水平均显著降低(p<0.05),而各组之间并无差异。随着去势后ovx组fsh水平的逐渐增加,vhh-3f9、igg注射骨质疏松症sd大鼠明显抑制了fsh的增加,且igg效果强于vhh-3f9,但是差异并不显著。ovx+le组,随着注射le时间的延长,FSH水平显著降低,发现LE的施加显著抑制FSH(P<0.05)。LH的变化与FSH趋势一致,但OVX+VHH-3F9组LH水平高于OVX+IgG组。从而通过抑制FSH而达到治疗骨质疏松症的目的。综上所述,本研究在建立SD大鼠骨质疏松症动物模型的基础上,通过从噬菌体免疫文库中筛选得到亲和力较高的抗FSHR纳米抗体,免疫骆驼得到效价较高的抗FSHR多克隆抗体IgG,并用于实验动物SD大鼠骨质疏松症的治疗,以亮丙瑞林作为抑制FSH激素水平的对照,以确定抗FSHR抗体对于大鼠骨质疏松症的治疗效果。为将来进一步预防骨质疏松筛选有效药物做一基础研究,以便用于临床诊断及骨质疏松症的预防。