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研究背景糖基化终末产物(Advanced glycation endoproducts,AGEs)在糖尿病多种血管并发症的发生、发展中起重要作用。病理浓度的AGEs通过激活氧化应激,诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成,从而破坏内皮细胞功能,进而在糖尿病血管并发症的发生、发展中起重要作用。新型降糖药胰高血糖素样肽1(Glucagon like Peptide-1,GLP-1)可通过降低血糖,改善微环境而间接保护内皮细胞,也可通过受体或非受体依赖性途径直接改善内皮功能,抑制动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生、发展。国外研究发现GLP-1通过降低内皮细胞的纤溶酶原激活物抑制因子1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)、血管粘附分子(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1, Vascular cell adhesion molecule, VCAM-1)的水平,减少高凝状态和炎症反应对内皮的损伤。此外,研究还发现GLP-1呈剂量依赖性降低AGEs诱导下内皮细胞的ROS水平；蛋白激酶A-内皮型一氧化氮合酶(Protein kinase A-Endothelial nitric oxide synthase, PKA-eNOS)信号通道是GLP-1抑制AGEs诱导的细胞损伤、促进内皮细胞增殖的重要作用机制之一；GLP-1还可通过环磷酸腺苷／蛋白激酶A (Cyclic Adenosine monophosphate/Protein kinase Asystem,cAMP/PKA)信号途径减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(Triphosphopyridine nucleotide,NADPH)合成,从而降低肾血管内皮细胞氧化损伤。研究目的建立AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)模型,探讨GLP-1是否具有拮抗AGEs诱导的氧化应激从而保护血管内皮细胞的作用,并探讨GLP-1是否可通过NADPH-、PKA-eNOS信号途径发挥抗氧化、抗凋亡及抗线粒体损伤的作用。研究方法1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离、培养及鉴定。标本均来源于广东药学院附属第一医院妇产科正常足月妊娠新生儿脐带经消毒、冲洗、0.1%的I型胶原酶消化、收集等步骤得到分离的细胞。分离后接种细胞于培养瓶,置于37℃、5%二氧化碳(Carbon dioxide, CO2)培养箱中培养。待细胞生长融合达80%以上时,进行消化传代,取生长良好的第3代细胞用于鉴定。使用免疫荧光法检测内皮细胞的标志物第Ⅷ因子相关抗原(Von Willebrand factor, vWF).2.建立AGEs诱导的HUVECs氧化损伤模型,探讨AGEs对内皮细胞的损伤作用。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)与D-葡萄糖溶于PBS中,避光孵育12周制备AGES。荧光分光光度计鉴定AGEs。以同样条件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制备的溶液作为本实验的阴性对照组。实验分为：空白对照组、AGEs (100、200、400、600、800 ug/mL)组,以上6组作用HUVECs24 h(该部分结果将确定AGEs作用浓度,之后本论文的AGEs及BSA浓度不再特别说明,均采用该浓度)；以上确定作用浓度的AGEs分别作用HUVECs 12、24、36、48 h,另设一空白对照组。每孔加入10μM二氯荧光黄双乙酸盐(Dichlorofluorescein diace-tate,DCFH-DA),经流式细胞仪检测荧光强度。确定BSA及AGEs作用浓度及时间后,实验分为：空白组、BSA组、AGEs组。配置四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3 ’-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1)工作液后与HUVECs共孵育,经流式细胞仪进行荧光检测细胞线粒体膜电位的变化。按磷脂酰丝氨酸结合蛋V/碘化丙啶(Annexin V/Propidium iodide, Annexin V/PI)凋亡试剂盒说明书要求处理细胞后,经流式细胞仪分析细胞凋亡。3.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酸氧化酶4 (Triphopyridine nucleotideoxidase 4, NOX4)在GLP-1对AGEs诱导血管内皮细胞中的作用。空白对照组、BSA组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组,通过蛋白印迹法(Western Blotting法)检测NOX4蛋白表达。GLP-1预处理细胞30 min后再加入AGEs, GLP-1浓度采用100 nM。(本课题前期研究显示,该浓度下GLP-1可显著抑制AGEs诱导的细胞凋亡。)(以下部分均按该顺序操作,不再赘述。)空白对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组,通过逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PC, RT-PCR)检测HUVECs的NOX4信使核糖核酸(Messenger RNA, mRNA)表达。空白对照组、AGEs组、AGEs+阴性对照siRNA组、AGEs+NOX4siRNA组,检测NOX4表达抑制前后,HUVECs的细胞凋亡率、ROS及线粒体膜电位水平。采用lipo-2000进行NOX4干扰性小核糖核酸(Small interfering RNA, siRNA)转染,阴性干扰组采用乱序的siRNA为错配对照组,应用RT-PCR鉴定转染结果。4.蛋白激酶A-(Protein kinase A, PKA-)、内皮型一氧化氮合酶-(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS-)在GLP-1对AGEs诱导血管内皮细胞中的作用空白对照组、BSA组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组分别检测PKA蛋白表达。空白对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+GLP-1+PKA抑制剂组,检测细胞eNOS蛋白表达、ROS生成水平及细胞凋亡率空白对照组、BSA组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+GLP-1+eNOS抑制剂组,检测细胞一氧化氮(Ntrogen monoxide, NO)生成水平及细胞凋亡率。抑制剂预处理细胞1h后,加入(或不加)GLP-1 100 nM干预30 min,最后加AGES。统计学处理数据采用SPSS17.0进行统计分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,统计方法采用单向方差分析(One-Way ANOVA),其中两两比较采用LSD法,相关分析采用Spearman相关分析法,P<0.050为差异有统计学意义。结果1.充分掌握好消化时间,可得到纯度较高的HUVECs。2.当AGEs作用浓度达400 ug/mL时,细胞ROS含量荧光值达到最大,当AGEs作用24 h后,细胞ROS含量荧光值达到最大。3.GLP-1抑制AGEs诱导的血管内皮细胞损伤。与空白组相比,BSA不影响内皮细胞ROS生成(P=0.996),AGEs处理组较空白组ROS生成明显增多(P=0.007),而GLP-1与AGEs共孵育组较AGEs单独处理组的ROS荧光强度明显减弱(P=0.010)。对AGEs诱导的内皮细胞凋亡及细胞线粒体膜电位下降,加入GLP-1后可显著降低细胞凋亡率(P=0.000),升高线粒体膜电位(P=0.014)。4.NOX4在GLP-1对AGEs诱导血管内皮细胞中的作用。AGEs促进内皮细胞NOX4基因表达及其蛋白的合成,与空白对照组相比差异有显著统计学意义(P值分别为0.000和0.001)；在AGEs组加入GLP-1后,可显著抑制内皮细胞NOX4基因的表达及蛋白合成,与AGEs组相比差异有显著统计学意义(P值分别为0.000和0.003)。在AGEs诱导下,抑制NOX4mRNA表达后,内皮细胞ROS含量荧光值显著降低,与单纯AGEs处理组及AGEs+阴性干扰组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.011和0.010)。干扰NOX4mRNA基因表达可显著拮抗AGEs诱导的细胞凋亡及线粒体膜电位下降(P值分别为0.000和0.017),而予以非NOX4siRNA的小干扰处理则不影响细胞凋亡率及线粒体膜电位(P值分别为0.169和0.741)。5.PKA-在GLP-1对AGEs诱导血管内皮细胞中的作用。与空白对照组相比,BSA并不影响内皮细胞PKA蛋白表达(P=0.186),而AGEs可诱导内皮细胞的PKA蛋白表达显著下调(P=0.003)；与AGEs单独处理组相比,加入GLP-1共孵育后,AGEs诱导的PKA蛋白较AGEs组显著上调(P=0.003)。AGEs组加入GLP-1后,其ROS含量荧光值较单纯AGEs组降低,差异有统计学意义(P=0.013)；AGEs+GLP-1组加入PKA抑制剂H-89·2HCl后,细胞ROS含量较加入H-89·2HCl前升高(P=0.045),即抑制PKA蛋白表达后可部分拮抗GLP-1对AGEs诱导内皮细胞ROS生成的抑制作用。GLP-1与AGEs共孵育组的细胞凋亡率显著低于AGEs组(P=0.001); PKA抑制剂H-89·2HCl可显著拮抗GLP-1对AGEs诱导细胞凋亡的抑制作用(P=0.010)。GLP-1与AGEs共孵育组的细胞线粒体膜电位显著高于AGEs组(P=0.011)；加入PKA抑制剂H-89·2HCl后,与AGEs+GLP-1组相比,细胞线粒体膜电位显著降低(P=0.021)6. eNOS-在GLP-1对AGEs诱导血管内皮细胞中的作用。与空白组相比,AGEs可诱导内皮细胞eNOS蛋白表达显著下调(P=0.004)；在AGEs中加入GLP-1后,可使受抑制的eNOS蛋白表达再次上调(P=0.035)；AGEs组予以H-89-2HCl干预后,AGEs对eNOS蛋白表达的抑制作用无明显改变(P=0.908)；而AGEs+GLP-1组予以H-89·2HCl干预后,细胞eNOS蛋白表达受抑制(P=0.045)。eNOS抑制剂L-NAME干预前,AGEs+GLP-1组较AGEs组NO水平显著升高(P=0.017),细胞凋亡率显著降低(P=0.000)。L-NAME干预后,AGEs+GLP-1组NO生成明显受抑制(P=0.017),且细胞凋亡率增加(P=0.011)。结论1.成功建立一种能大量分离HUVECs的体外培养方法。2.GLP-1可通过抑制NOX4或激活PKA信号通道,拮抗AGEs诱导的HUVECs氧化应激及线粒体损伤,从而发挥内皮细胞保护作用。3.在AGEs诱导的HUVECs损伤中,GLP-1可通过PKA-eNOS-NO信号通道发挥保护作用。