急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）是由急性肺损伤（acute lung injury,ALI）的引发的呼吸性衰竭,在美国ARDS/ALI每年的受累人群可达到200000,临床研究显示约60%ARDS患者可出现肺纤维化,给社会带来严重的经济负担。目前普遍认为血管紧张素系统（Angiotensin,ANG）紊乱与ARDS/ALI发病过程密切相关,其过度激活可导致肺内皮细胞凋亡诱发肺泡-毛细血管膜通透性的改变。血管紧张素II（Angiotensin II,ANG II）作为肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）系统最为重要的效应因子,它分布于体液循环系统及包括肺组织在内的多个重要器官中,研究证实ANG II表达升高与氧化应激、血管通透性改变及炎症细胞浸润等多个病理事件相关,在ALI动物模型及患者体内均可检测到高表达的ANG II。血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE 2）是RAS系统的另一重要成员,尽管它与血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）催化活性区域具有61%的同源性,但其生物学活性却与ACE截然不同。RAS系统中,ACE可使血管紧张素I（Angiotensin I,ANG I）分解形成ANGII,ANGII与其特异性受体AT1a结合后可发挥促血管收缩、促炎症反应、促细胞增殖及细胞凋亡等生物学效应,而ACE2则可促ANGII降解生成保护效应因子血管紧张素-（1-7）（The heptapeptide Angiotensin 1-7,ANG1-7）,其与Mas结合后可抑制ANGII肺损伤作用,证实ACE2在ALI发生过程中有着重要的调控作用。胎盘生长因子（Placental growth factor,PLGF）作为一种与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）有着高度同源性的糖蛋白,广泛表达于包括肺组织在内的多种器官中,具有促内皮细胞增殖分化,促血管生成、促炎症因子释放及抗凋亡作用。血管内皮生长因子受体-1（VEGF receptor 1,VEGFR1,or Flt-1）是PLGF的关键性受体,而可溶性血管内皮生成因子受体1（Soluble Flt-1,s Flt-1）作为内源性血管形成通路的负调控因子,能与Flt-1竞争性结合PLGF,因其缺少酪氨酸激酶活性可对血管发生信号发挥拮抗作用。以往研究显示成人肺组织中VEGF表达量明显高于其它器官,而ALI/ARDS病理状态下肺组织内VEGF水平可进一步升高至正常水平的两倍,伴随肺泡表面物质的释放及肺组织血管通透性增加,提示VEGF表达增加与ALI/ARDS患者病理变化密切相关。动物模型研究发现应用sFlt-1干预VEGF信号传递不仅能有效改善肺损伤模型水肿及肺纤维化程度,对炎症反应及血管过度发生也有一定的拮抗作用,提示VEGF家族成员在ALI/ARDS发生过程中可能有着重要的调控作用。鉴于ACE2及PLGF/Flt-1途径对肺泡-毛细血管功能的调控作用,目前对其在ALI/ARDS发生过程中关联性研究尚属空白,因此本研究以博莱霉素（Bleomycin,BLM）刺激Balb/c小鼠建立的急性肺损伤小鼠模型为研究对象,应用HE染色观察、血气分析仪、分光光度计、伊文思蓝法、Wester-blot等实验技术,检测急性肺损伤小鼠模型肺组织中相应指标的变化来探讨肺损伤时外源性给予ACE2干预对急性肺损伤小鼠模型的保护作用及其可能的作用机制,探讨ACE2、PLGF及s Flt-1对急性肺损伤模型血管通透性及呼吸功能的可能作用,并对三者关联性进行初步探讨,为急性肺损伤的预防及治疗提供临床依据。本课题共分为三部分,具体如下:第一部分ACE2对小鼠急性肺损伤影响的研究目的:BLM刺激后建立急性肺损伤小鼠模型,探讨ACE2对急性肺损伤小鼠模型的保护性,以进一步明确其在急性肺损伤过程中的可能作用。方法:Balb/c小鼠适应性饲养1周后随机分为3组:对照组（Control group,n=30）、ALI模型组（ALI group,n=30）及ACE2干预组（ACE2 group,n=30）。BLM刺激后建立急性肺损伤小鼠模型,对照组:给予小鼠尾静脉注射PBS缓冲液。ALI模型组:给予小鼠尾静脉注射PBS缓冲液。ACE2干预组:给予小鼠尾静脉注射ACE2。收集血液及肺组织;HE染色观察小鼠肺组织结构并参照评分准则评价肺脏损伤程度;血气分析仪测定血氧饱和度、O₂Sat及pO₂;分光光度法检测小鼠肺组织MDA及SOD含量;伊文思蓝法评价各组小鼠肺组织毛细血管通透性及变化;Western-blot法分析各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6及CXCL-1蛋白表达水平。结果:1.各组小鼠一般情况对照组小鼠术后恢复较好,行为活泼灵敏,进食正常。ALI模型小鼠术后死亡1只,其它存活小鼠可见精神萎靡,食欲不佳,伴随体重减轻,毛色光泽度也较差。ACE2干预组小鼠死亡1只,存活小鼠饮食及进食均表现正常。2.肺组织病理学检查及肺损伤评分对照组（Control group）小鼠肺组织给药3天后结构正常,肺泡间隔无增厚,肺泡腔大小均匀、完整,无红细胞、炎性细胞浸出。模型组（ALI group）给予BLM 3 d后出现局部细胞水肿,肺泡间隔略微增厚,可见单核细胞及炎性细胞渗。BLM给药7 d后肺部局部炎症好转,但肺泡结构紊乱,伴随肺泡壁明显增宽,间质血管增生扩展,血管充血出现管壁增粗,可见大量炎性细胞浸润。对应时间点内观察ACE2干预组（ACE2 group）HE染色结果显示,造模后给予ACE2干预3 d后可见小鼠肺组织轻度细胞水肿,少量单核细胞浸润,与ALI模型组相比其损伤程度较轻,给予ACE2干预7 d后,肺组织内炎症反应发生扩展,但与ALI模型组相比,其肺泡结构破坏较少,且肺泡间隔增厚程度较轻。参照评分准则评价肺脏损伤程度,结果显示ALI模型组（ALI group）给予BLM干预3 d及7 d后肺组织损伤评分分别为（5.94±1.33）分和（9.21±2.93）分,与对照组（Control group）相比显著增加,且伴随干预时间的延长,BLM所致肺脏损伤程度呈加重趋势。ACE2组（ACE2 group）给予ACE2干预3 d及7 d后肺组织损伤评分分别为（3.31±1.78）分和（5.69±3.41）分,与模型组相比明显降低,提示ACE2干预后可有效缓解BLM所致肺脏损伤程度。3.各组动脉血气分析BLM造模后3 d及7 d小鼠pO₂值分别为（75.18±6.70）mmHg和（62.17±9.39）mmHg,与对照组相比显著降低（P<0.05）,ALI模型小鼠给予ACE2干预后其3 d及7 d pO₂值分别为（84.08±4.83）mmHg和（79.11±8.46）mmHg,与模型组相比ACE2干预组pO₂值均表现为不同程度升高。3 d及7 d对照组小鼠O₂Sat值（96.97±0.64）%和（97.08±0.66）%,给予BLM干预后其值分别降至（93.75±1.89）%和（89.34±4.55）%,与对照组相比显著降低（P<0.05）,ACE2干预3 d后可提高动脉血氧饱和度至（95.62±0.93）%,但对7 d组小鼠血氧饱和度无明显的干预作用。4.各组肺湿/干重比BLM造模后3 d及7 d小鼠肺湿/干重比分别为（6.80±0.68）和（7.65±0.62）,与对照组相比显著升高（P<0.05）,ALI模型小鼠给予ACE2干预后,小鼠肺湿/干重比均得到不同程度的降低,其值分别为（5.81±0.58）和（6.88±0.48）。5.各组肺脏组织SOD活性及MDA含量变化ALI模型组小鼠3 d及7 d肺脏组织MDA含量分别为（9.31±1.35）nmol/mg prot和（13.45±4.40）nmol/mg prot,与对照组相比存在显著性差异（P<0.05）。ACE2干预3 d和7 d后,ALI模型小鼠肺脏组织MDA含量分别降低至（6.35±2.27）nmol/mg prot和（9.10±2.89）nmol/mg prot。对照组肺脏组织SOD活性分别为（10.07±1.10）U/mg prot和（9.72±0.92）U/mg prot,与对照组相比,ALI模型组小鼠肺脏组织SOD活性显著降低,其值分别为（7.64±1.32）U/mg prot和（6.27±1.25）U/mg prot,给予ACE2干预后并未影响模型组小鼠肺脏SOD活性。6.各组伊文思蓝含量变化BLM造模3 d及7 d小鼠肺组织中伊文思蓝含量分别为（157.43±12.45）ng/mg和（193.17±17.89）ng/mg,明显高于对照组（58.93±4.67）ng/ml,ACE2干预3 d及7 d肺组织匀浆上清伊文思蓝含量分别为（77.33±21.14）ng/mg和（129.92±10.34）ng/mg,与ALI模型组显著降低。7.各组肺组织TNF-α、IL-6及CXCL-1蛋白表达水平与对照组相比,给予小鼠BLM干预7 d后,小鼠肺组织中TNF-α、IL-6及CXCL-1蛋白表达显著增高（P均<0.01）,ACE2协同处理可显著下调ALI模型组小鼠肺组中TNF-α、IL-6及CXCL-1蛋白表达水平（P分别<0.05,<0.05,<0.01）。小结:1.BLM可诱发小鼠急性肺组织损伤,表现为肺通透性升高,血气分析结果为氧分压及氧饱和度的降低。临床病理学检测可见炎症细胞渗出伴随肺间质增厚,肺组织TNF-α、IL-6及CXCL-1蛋白表达水平明显升高,进一步证实急性肺损伤可能和介导肺组织炎症介质释放相关。2.ALI可诱发小鼠肺组织的氧化应激损伤,检测结果显示小鼠肺组织中SOD活性明显降低,MDA含量明显增高,提示氧化应激损伤可能参与了介导小鼠急性肺损伤的发生。3.外源性ACE2应用于ALI小鼠后,肺泡-毛细血管通透性降低,肺组织的水肿程度减轻,肺组织中TNF-α、IL-6及CXCL-1表达降低,MDA含量降低,抑制肺组织炎症及氧化损伤程度,证实ACE2对小鼠急性肺损伤具有保护性作用。第二部分ACE2对急性肺损伤小鼠肺组织线粒体功能影响的研究目的:BLM诱导建立急性肺损伤小鼠模型,给予ACE2干预后对线粒体结构的完整性及功能进行评价,以明确ACE2对BLM致急性肺损伤小鼠模型肺组织线粒体的可能作用。方法:采用BLM刺激后建立急性肺损伤小鼠模型,小鼠尾静脉注射ACE2后,收集肺组织,分离获得线粒体后,荧光酶标仪检测肺组织线粒体膜电位;Western-blot法分析各组小鼠肺组织胞浆及线粒体cytochrome C蛋白表达水平。结果:1.ACE2对各组小鼠线粒体膜电位△ψm影响ALI模型组（ALI group）小鼠线粒体荧光强度为（228.57±68.57）显著低于对照组（594.29±82.29）,P<0.01,差异具有统计学意义,提示BLM可破坏小鼠肺组织线粒体膜结构完整性。ACE2干预组（ACE2 group）给予小鼠尾静脉注射ACE2后结果显示肺组织线粒体荧光强度为（416.02±80.98）,较ALI模型组明显增强（P<0.05）,表明ACE2可一定程度逆转BLM对小鼠肺组织线粒体膜的损伤作用。2.ACE2对各组小鼠线粒体cytochrome C蛋白表达影响对照组（Coutrol group）线粒体cytochrome C蛋白表达水平为（0.32±0.06）高于胞浆的（0.23±0.08）。ALI模型组（ALI group）BLM干预后线粒体内cytochrome C蛋白表达量为（0.09±0.03）显著下调,伴随胞浆内cytochrome C含量（0.58±0.17）的增加。ACE2干预组（ACE2group）给予ACE2干预后,线粒体内cytochrome C蛋白表达量为（0.26±0.08）,一定程度恢复ALI模型肺组织线粒体cytochrome C含量,而胞浆内cytochrome C蛋白表达量为（0.35±0.12）,其分布下调。小结:1.ALI时可破坏小鼠肺组织线粒体膜结构完整性,影响线粒体膜通透性,给予ALI模型小鼠尾静脉注射ACE2一定程度逆转BLM对小鼠肺组织线粒体膜的损伤作用。2.ALI后小鼠肺组织线粒体cytochrome C释放至胞浆,提示ALI时可激活线粒体凋亡途径,ACE2干预后可一定程度恢复ALI模型肺组织线粒体cytochrome C表达,发挥抗凋亡作用。第三部分ACE2、PLGF及s Flt-1对急性肺损伤小鼠肺泡通透性及呼吸功能调控作用的研究目的:明确ACE2、PLGF及sFlt-1对急性肺损伤模型血管通透性的可能作用,分析三者的关联性。方法:Balb/c小鼠适应性饲养1周后随机分为4组:PLGF对照组（ALI+ACE2+PBS group,n=40）、sFlt-1对照组（ALI+PBS group,n=40）、ACE2+PLGF干预组（ALI+ACE2+PLGF group,n=40）、sFlt-1干预组（ALI+sFlt-1 group,n=40）;伊文思蓝法评价各组小鼠肺组织毛细血管通透性变化;Buxco小动物肺功能检测系统测定各组小鼠气道阻力;Western-blot法分析各组小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达变化。结果:1.ACE2对ALI模型小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达影响与对照组相比,ALI模型组小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达水平显著上调,ACE2干预后对模型组小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达水平无明显作用,提示ACE2并不会影响肺组织PLGF及VEGFR-1表达。2.外源性PLGF可拮抗ACE2对ALI模型肺组织血管通透性的改善作用BLM干预建立急性小鼠肺损伤模型,尾静脉注射ACE2后,给予小鼠背部植入微量渗透泵,持续7 d恒速注射PLGF共10 ng,分别于0 d、3 d及7 d经尾静脉给予小鼠注射1%伊文思蓝,分离肺组织剪碎后浸泡于甲酰胺溶液,测定各组肺组织匀浆上清OD值并计算伊文思蓝含量,结果显示ACE2可降低ALI模型组小鼠肺组织伊文思蓝含量,且与作用时间呈正相关性;微量渗透泵注射PLGF 3 d及7 d时小鼠肺组织伊文思蓝含量明显高于对照组,提示外源性补充PLGF可拮抗ACE2对ALI模型小鼠肺血管的保护作用。3.外源性PLGF可拮抗ACE2对ALI模型肺功能改善作用经乙酰甲胆碱雾化刺激后各组气道阻力逐渐升高,与乙酰甲胆碱使用剂量有着明确的量效关系。微量渗透泵注射PLGF组小鼠的气道阻力与对照组相比变化幅度较大,变化速率也明显加快,提示外源性补充PLGF可抑制ACE2对小鼠气道反应性的调控作用。4.外源性sFlt-1对ALI模型肺组织血管通透性影响与ALI模型组相比,微量渗透泵注射sFlt-1 3 d及7 d后小鼠肺组织伊文思蓝含量显著降低,表明外源性补充sFlt-1可改善ALI模型小鼠肺组织血管通透性。5.外源性sFlt-1对ALI模型肺功能影响乙酰甲胆碱雾化刺激后ALI模型组小鼠气道阻力逐渐升高,而sFlt-1干预组小鼠气道阻力的升高幅度及速率均明显低于ALI模型组,提示微量渗透泵注射s Flt-1可改善ALI模型小鼠的肺功能。小结:1.外源性补充ACE2不会影响ALI模型小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达。2.外源性补充PLGF可拮抗ACE2对ALI模型小鼠肺血管的保护作用,表现为血管通透性改变及气道阻力增加。3.外源性补充sFlt-1可拮抗ALI对小鼠肺血管损伤作用,改善肺组织血管通透性,降低气道阻力。4.外源性补充ACE2及sFlt-1均可改善ALI模型小鼠呼吸功能,外源性补充PLGF可拮抗ACE2对肺组织的保护作用,ACE2并不会直接影响PLGF及VEGF-1表达,推测PLGF对ACE2拮抗作用可能是通过干预下游信号传递实现的。结论:综合以上三部分实验,得出结论如下:1.ALI通过引发肺组织炎症损伤及氧化应激损伤参与小鼠急性肺组织损伤的过程,导致呼吸功能障碍,血气分析结果为氧分压及氧饱和度的降低。2.外源性ACE2通过降低肺泡-毛细血管通透性、改善肺组织的水肿程度、抑制肺组织炎症及氧化损伤程度,对小鼠急性肺损伤模型具有保护性作用。3.ALI通过激活线粒体凋亡途径破坏小鼠肺组织线粒体膜结构完整性,进一步影响线粒体膜通透性。ACE2主要通过增加ALI模型肺组织线粒体cytochrome C表达,参与发挥抗凋亡作用,且ACE2不会影响ALI模型小鼠肺组织PLGF及VEGFR-1表达。4.PLGF可拮抗ACE2对ALI模型小鼠肺血管的保护作用,表现为血管通透性改变及气道阻力增加,其具体机制可能是通过干预下游信号传递实现。5.ACE2及s Flt-1可拮抗ALI小鼠肺血管的损伤,均可改善ALI模型小鼠肺功能,但是外源性补充PLGF可拮抗ACE2对肺组织的保护作用。