研究背景:创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是指由多种因素(坠落事件、汽车撞车事故、运动碰撞、火器袭击及爆炸等)导致的外部机械力作用于大脑的而产生的脑损伤。在一些发达国家,TBI被认为是45岁以下人群致死或致残的首要病因,仅在美国,多达约170万人每年患有不同程度的TBI,其中5万多人死于创伤,23万住院幸存者中至少35%将面临长期残疾。随着社会经济水平的提高和交通事业的发展,颅脑外伤的发病率以及颅脑外伤导致的致死率和致残率在中国也呈现逐渐上升趋势。TBI会导致短暂或永久的躯体运动障碍、认知功能障碍以及心理功能障碍,是临床工作中经常遇到的问题。冲击波诱导的创伤性脑损伤(blast induced traumatic brain injury,b TBI)是一种重要以及独特类型的TBI,在局部战争、反恐行动以及民用环境下都有发生。简易爆炸装置(improvised explosive devices,IEDs)诱导的脑损伤是当前国际局部战争(包括反恐)中平民和士兵伤亡的主要原因。IEDs引起的TBI可导致不同程度的认知和行为损害,但其确切的脑组织病理生理机制尚不清楚以及理想的动物模型仍欠缺。不同于其他TBI动物模型:控制性皮质击打(controlled cortical impact injury,CCI)动物模型以及液压冲击伤(fluid percussion injury,FPI)动物模型都有商品化的动物模型,b TBI动物模型由于其爆炸源的不同、原理的差异以及暴露部位的不同等,不同实验室研制的模型差异很大,为我们一致性的研究以及阐释b TBI带来了很多困扰。因此,迫切需要建立一种小型的便于复制的能产生更接近真实世界人b TBI的动物模型,以进一步深入阐明b TBI的发病机制,寻找新的有效的治疗方法。认知功能障碍是TBI尤其是b TBI的重要后遗症,严重影响患者的生活质量,是临床面临的一个重大课题,已吸引越来越多学者的关注。流行病学和实验数据表明,冲击波暴露可导致长期行为变化以及记忆力受损,其特点是学习记忆能力的迅速受损,已被认为是最近在伊拉克和阿富汗军事行动的标志性损伤。不同于阿尔兹海默病等其他神经退行性疾病,b TBI或TBI后认知功能障碍呈现出以下特点:出现早、进展迅速、持续时间伴随后半生以及以工作记忆受损为主要表现症状。因此研究如何改善TBI后认知功能障碍是一项亟待解决的重大课题,虽然越来越多的动物研究集中在b TBI的病理生理学机制上,但迄今为止尚无有效的针对b TBI的有前景的药物。因此,深入研究b TBI的发病机制,寻找有效的干预策略或药物来改善b TBI所致的神经和认知功能缺损具有重要意义和迫切需要,无论在军事方面和民用方面都有具有重要的应用前景。胸腺素α1(Tα1)是从胸腺生成素组份V中分离纯化的一种由28个氨基酸组成的小分子多肽。Tα1是一种多效性药物,可以增强细胞免疫,表现出抗肿瘤和抗炎特性,已在感染疾病、免疫缺陷疾病和癌症患者中得到验证或临床应用。此外,Tα1已被证实可以减轻胰腺病变和糖尿病,显示出抗动脉粥样硬化的作用,刺激内皮细胞迁移和伤口愈合,以及在动脉粥样硬化兔模型中表现出抗氧化应激损伤效应。胸腺切除不仅会导致小鼠免疫缺陷,而且还会降低其的学习和记忆能力,提示胸腺肽类物质可能参与学习记忆功能的调控。而且已有研究证实Tα1可促进新生正常小鼠神经再生和认知功能,提示Tα1可调节正常小鼠的认知功能。Tau蛋白属于微管相关蛋白(MAP)家族。磷酸化的tau聚集体进一步导致神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)的形成,这已被广泛认为是许多神经退行性疾病和脑外伤的共同病理特征。先前的研究以及我们未发表的资料表明,Tα1可能调节微小兴奋性突触后电位(miniature excitatory postsynaptic potential,m EPSP),提示Tα1可能调节神经系统功能。TBI或b TBI伴随着严重的后遗症,如认知功能障碍和神经炎症反应。然而,Tα1是否能改善b TBI后的认知功能障碍和Tau蛋白功能障碍仍不清楚,针对此方面的研究具有较强的创新性和实用性。本研究拟建立一种新型基于压缩空气爆炸的单纯颅脑暴露、模拟真实世界的b TBI模型,并利用该模型研究Tα1治疗能否改善颅脑爆炸伤所致神经和认知功能障碍,并探讨了其可能的机制。本研究有望为研究颅脑爆炸伤提供一种可靠的动物模型,并为研究颅脑爆炸伤机制以及新的药物或靶点提供新的学术见解。研究目的:1.本课题旨在研究一种新的具有高度生物力学和生物医学稳定性的基于压缩空气单纯颅脑暴露的b TBI模型,并探讨爆炸伤导致认知功能障碍的具体机制以及进一步研究颅脑爆炸伤的病理生理学机制。2.阐明Tα1能否改善颅脑创伤后认知功能障碍以及可能的机制,为研究颅脑爆炸伤机制以及新的药物或靶点提供新的学术见解。研究方法:1.压缩气体驱动冲击波发生器的设计。1.1结合课题组的工作基础与现有颅脑爆炸伤动物模型的文献进行创新性设计。1.2探索建立一种更接近战场环境的大鼠b TBI动物模型。在河北省某大型露天环境中进行了TNT介导b TBI模型的初步探索实验。整个爆炸过程都是用高速摄影机拍摄的。PCB传感器被放置在同一高度和圆周上采用DEWESoft冲击波记录仪以测量冲击波特性。1.3设计压缩气体驱动的b TBI模型并完成生物力学指标的验证以及相应的操作说明。重视解决爆破片的稳定性问题。探讨不同凹槽厚度铝片爆破片的稳定性和一致性。采用PCB传感器结合DEWESoft冲击波记录仪检测冲击波发生装置的冲击波超压特性。记录了峰值超压、上升时间、持续时间和正冲量。对b TBI模型进行了可行性分析。根据铝片凹槽厚度的不同,将冲击波发生器的冲击波超压特性分为0.5mm、0.6mm、0.7mm和0.8mm组分别记录。根据距爆炸源距离的不同,将其分为20cm、35cm、50cm、65cm、80cm和95cm组分别记录。2.一种新的大鼠颅脑爆炸伤动物模型的建立。2.1计算距爆炸源不同距离下大鼠的24小时死亡率,同时用PCB传感器结合DEWESoft冲击波记录仪检测不同距离下的冲击波超压,用线性回归的方法建立用冲击波超压去预测大鼠爆炸伤后24小时死亡率的ROC曲线模型,同时评估其预测效能。2.2冲击波损伤的剂量效应:采用0.6mm厚凹槽铝片做为爆破片,分为4组:假爆炸组(除不接受爆炸冲击,剩余的与其他组相同);低强度水平爆炸组(距爆炸源距离为80cm);中强度水平爆炸组(距爆炸源距离为50cm);高强度水平爆炸组(距爆炸源距离为20cm)。2.3冲击波损伤的时间效应:采用0.6mm厚凹槽铝片做为爆破片,固定大鼠的位置为距离爆炸源20cm,分为6组:假爆炸组(除不接受爆炸冲击,剩余的与其他组相同);爆炸伤后2h组;爆炸伤后12h组;爆炸伤后24h组;爆炸伤后3d组;爆炸伤后7d组。2.4采用水迷宫实验研究冲击波损伤对爆炸伤后大鼠认知功能的影响,并分成4组:假爆炸组(除不接受爆炸冲击,剩余的与其他组相同);低强度水平爆炸组(距爆炸源距离为80cm);中强度水平爆炸组(距爆炸源距离为50cm);高强度水平爆炸组(距爆炸源距离为20cm)。2.5采用Western blot技术检测单次冲击波损伤对大鼠爆炸伤后海马tau蛋白表达和磷酸化的影响。2.6采用HE染色观察单次冲击波损伤对大鼠脑组织显微病理的影响,并按照剂量效应和时间效应分别观察。2.7采用流式细胞术检测单次冲击波损伤对大鼠血液中CD4+T细胞、CD4+T细胞以及调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)等的影响,并观察其时程变化规律。2.8采用血常规自动分析仪检测单次冲击波损伤对大鼠血液中淋巴细胞和中性粒细胞百分比的影响。2.9采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术检测单次冲击波损伤对大鼠血液中炎症因子IL-6的影响。2.9采用称重法检测单次冲击波损伤对大鼠颅脑爆炸伤后脑组织水含量的影响。3.Tα1对大鼠颅脑爆炸伤后认知功能障碍的作用和机制。3.1为探讨Tα1对大鼠b TBI后2 4小时死亡率的影响。大鼠接受Tα1治疗(浓度为200μg/kg,溶于1ml生理盐水,每日2次)或相同频次和体积的生理盐水治疗。根据实验设计分成4组:假爆炸组(除不接受爆炸冲击,剩余的与其他组相同);爆炸组(距爆炸源距离为20cm);爆炸+生理盐水(normal saline,NS)治疗组(距爆炸源距离为20cm);爆炸+Tα1治疗组(距爆炸源距离为20cm),分别计算各组24小时死亡率,明确Tα1对大鼠颅脑爆炸伤有无保护作用。3.2采用水迷宫实验研究Tα1对爆炸伤后大鼠认知功能的影响,并分成4组:假爆炸组(除不接受爆炸冲击,剩余的与其他组相同);爆炸组(距爆炸源距离为20cm);爆炸+NS治疗组(距爆炸源距离为20cm);爆炸+Tα1治疗组(距爆炸源距离为20cm)。3.3采用Western blot技术检测Tα1对大鼠颅脑爆炸伤后海马tau蛋白表达和磷酸化的影响。3.4采用HE染色观察Tα1对大鼠颅脑爆炸伤后脑组织显微病理的影响。3.5采用流式细胞术检测Tα1对大鼠颅脑爆炸伤后血液中Treg细胞等的影响。3.6采用ELISA技术检测Tα1对大鼠颅脑爆炸伤后血液中炎症因子IL-6的影响。3.7采用称重法检测Tα1对颅脑爆炸伤大鼠脑组织水含量的影响。结果:1.高压氮气驱动的基于带有凹槽的铝片做为爆破片可以稳定的产生可重复性的冲击波。2.本研究成功的建立了一种新的基于压缩气体爆炸的大鼠颅脑爆炸伤动物模型。2.1将SD大鼠暴露在距爆炸源不同距离处,接受单次冲击波(0.6 mm厚的V型槽铝板做为爆破片)。随着距离由20 cm增加到95 cm,冲击波超压由136.44k Pa降至26.77k Pa,24小时死亡率由19.6%降至0。建立剂量-反应线性回归模型,预测模型为P=1/1+e(5.5-0.026X)(P:24小时死亡率;X:冲击波超压),通过冲击波超压去预测大鼠颅脑爆炸伤后24小时死亡率。该模型的受试者工作特征曲线具有较好的预测效能,表现为受试者工作特征曲线下面积为0.833(P<0.001)。2.2单次冲击波暴露导致大鼠学习记忆能力下降,具体表现为在定速巡航期潜伏期延长,在空间探索期穿台次数减少。2.3单次冲击波作用于大鼠头部伤后2h～7d,未见明显的挫伤、坏死、血肿、出血等显微脑组织损伤征象。此外,从低强度到高强度不同程度的冲击伤均未引起明显的神经病理改变、缺血性神经元或组织损伤。2.4单次冲击波暴露显著增加大鼠颅脑爆炸伤后海马Thr205表位tau蛋白磷酸化,且呈剂量和时间依赖性。而在伤后2h、12h、24h、3d和7d,不同程度的冲击波(由低强度到高强度)或相同的高强度冲击波暴露对大鼠海马组织中tau蛋白Ser404和Ser262表位的磷酸化和总tau表达无明显影响。2.5单次冲击伤后7d、2h、3d和12h,CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg T细胞和淋巴细胞的百分率均显著下降,而中性粒细胞百分率在单次冲击伤后12h显著升高。2.6单次冲击伤大鼠血浆中炎性细胞因子IL-6水平的变化呈时间依赖性。冲击伤后12h、24h以及3d大鼠血浆IL-6水平显著升高。2.7单次冲击波暴露可导致大鼠颅脑爆炸伤后2h、12h、24h和3d脑组织含水量增加。随着冲击波强度的增加,脑组织含水量明显增加。3.Tα1对颅脑爆炸伤后认知功能障碍的作用和机制。3.1 Tα1治疗可明显改善大鼠颅脑爆炸伤后认知功能障碍,具体表现为导致定速巡航期潜伏期减少,以及空间探索期穿台次数增多,在此过程中各个时间段Tα1并未显著影响整个实验中每天大鼠游泳速度。3.2 Tα1有降低大鼠爆炸伤后24小时死亡率的趋势,但无统计学意义。3.3 Tα1不显著改变颅脑爆炸伤后大鼠大脑的组织病理学。3.4 Tα1显著抑制大鼠颅脑爆炸伤后tau蛋白Thr205表位的磷酸化,但对tau蛋白Ser404和Ser262表位的磷酸化无明显影响。3.5 Tα1增加大鼠颅脑爆炸伤后3d的Treg细胞百分率。3.6 Tα1抑制大鼠颅脑爆炸伤后血浆IL-6的产生。3.7 Tα1可抑制大鼠颅脑爆炸伤后脑水肿,表现为降低脑组织含水量。结论:1.本研究建立了一种新的基于压缩气体爆炸的大鼠单纯颅脑暴露的b TBI模型,表现为以持续认知障碍、tau蛋白Thr205位点磷酸化增加、Treg细胞减少、炎症反应增加和脑水肿。2.Tα1改善了b TBI后大鼠的学习记忆能力下降,抑制了tau蛋白Thr205表位的磷酸化,增加了Treg细胞,并抑制了炎症反应和脑水肿,而不影响大鼠脑组织显微病理学。Tα1有望成为治疗一种新的有前景的治疗颅脑爆炸伤的药物。