甲状腺癌差异表达谱筛选及相关基因功能研究

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目的:利用二代测序技术探索甲状腺乳头状癌差异表达谱,筛选并探索相关差异表达基因在甲状腺乳头状癌中的相关作用。方法:(1)培养甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP、TPC-1、K1以及人正常甲状腺细胞系Nthy-1,利用二代测序技术获取差异表达转录组图谱,根据测序结果及文献参考筛选差异表达基因(C0L1A2、PDGFRA、THBS-1、TNC、ITGB4、PDGFB、FGFR4)进行下一步研究;(2)收集甲状腺乳头状癌患者的临床组织样本(癌组织及与其相邻3-5cm的癌旁组织)54例,培养甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP、TPC-1、K1以及人甲状腺正常细胞系Nthy-1,通过实时荧光定量PCR技术分别在组织水平上和细胞水平上对所筛基因的m RNA水平进行验证,综合验证结果与测序结果,进一步筛选差异表达的基因(ITGB4)。(3)提取甲状腺乳头状癌细胞系(TPC-1、K1、BCPAP)和正常的甲状腺细胞系(Nthy-1)总蛋白,采用Western blot检测细胞水平上ITGB4的蛋白表达情况,根据检测结果进一步确定目的基因ITGB4.(4)构建ITGB4-RNAi载体敲减BCPAP、TPC-1、K1细胞中的ITGB4表达量,利用荧光显微镜、实时荧光定量PCR技术和Western blot分别检测敲减效果。(5)通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Trans Well细胞侵袭实验探究ITGB4敲低对甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移与侵袭等能力的影响。结果:(1)根据转录组测序结果可知,甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP、TPC-1、K1与人甲状腺正常细胞系Nthy-1相比,差异表达的已知基因有1961个,其中显著上调的基因1179个,显著下调的基因782个。(2)综合测序数据与文献参考,初步筛选7个差异表达基因,其中COL1A2、PDGFRA、THBS-1、TNC显著下调,ITGB4、PDGFB、FGFR4显著上调,对这7个基因在甲状腺乳头状癌癌细胞系和病人组织样本中进一步验证,综合验证结果,筛选ITGB4作为目的基因。(3)ITGB4-RNAi载体成功转染K1细胞和BCPAP细胞,使K1细胞和BCPAP中ITGB4的表达量被显著敲低。(4)敲减后,BCPAP的增殖、迁移和侵袭能力显著受到抑制,K1细胞敲减后增殖能力、迁移和侵袭能力无显著变化。结论:(1)在甲状腺乳头状癌细胞系和正常细胞系基因差异表达谱中COL1A2、PDGFRA、THBS-1、TNC显著下调,ITGB4、PDGFB、FGFR4显著上调。(2)ITGB4-sh RNA敲低BCPAP、TPC-1、K1中ITGB4的表达量,其中BCPAP与K1细胞株能够被有效敲低,敲减后,BCPAP的增殖、迁移和侵袭能力被显著抑制,这表明ITGB4的异常表达对甲状腺乳头状癌的增殖、迁移和侵袭能力有一定影响。
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