妊娠后期到泌乳早期是奶牛生理和代谢适应的重要时期,分娩前胎儿和子宫的营养需求呈指数增长,而营养成分的摄入往往因为内分泌变化、分娩本身以及其他影响摄入的因素而减少,容易产生能量负平衡,这就会对奶牛的健康、繁殖以及乳制品的盈利能力产生直接影响。植物甾醇作为一种绿色食品、饲料添加剂已经广泛应用在人和动物上,其降血脂、抗炎、抗癌以及改善动物体质等作用已被人们所熟知。本试验利用体外发酵的方法,筛选出效果较好的植物甾醇,并在围产期奶牛日粮中进行适量添加,测定并分析其对围产奶牛瘤胃以及粪便微生物菌群与代谢的影响,探索植物甾醇对围产期奶牛微生物发酵的改善作用。1体外研究不同组分植物甾醇对瘤胃发酵参数的影响本试验旨在利用体外瘤胃发酵技术评定不同组分植物甾醇（甾醇A-E）对瘤胃发酵参数的影响。在含60 mL瘤胃培养液及600 mg全混合日粮的120 mL发酵瓶中分别添加0、2、6、12 μg溶于乙酸乙酯的植物甾醇,每组四个重复,39℃恒温培养24小时,于3、6、9、12、24 h读取产气量。发酵终止后计算累积产气量并测定底物降解率、氨氮、微生物蛋白、pH值及挥发性脂肪酸产量。结果表明:添加的植物甾醇组分、浓度对体外发酵底物干物质降解率和乙丙比均有显著影响（P<0.05）。甾醇组分对氨态氮浓度有显著影响（P<0.05）,氨态氮与菌体蛋白在植物甾醇组分上的变化规律相反。甾醇浓度对乳酸、菌体蛋白、总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸浓度以及pH值、总产气量（GP）有显著影响（P<0.05）,且组分与浓度在体外发酵总产气量、干物质降解率、菌体蛋白、乙丙比上均存在交互作用（P<0.05）。发酵结束后,所有分组的累积产气量均高于对照组,乳酸浓度均低于对照组;浓度为0.03 μg/mL的B甾醇组累积产气量与丙酸浓度最高,乳酸浓度最低,B组平均氨氮含量最低,浓度为0.03μg/mL分组的平均干物质降解率、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸最高。结果显示,在体外条件下,植物甾醇可以显著促进瘤胃发酵,改善瘤胃功能;添加甾醇B,添加浓度为0.03μg/mL时效果更为明显,此试验结果还需通过奶牛体内试验来进一步验证。2植物甾醇对围产期奶牛瘤胃微生物菌群与代谢的影响为探究植物甾醇对围产期奶牛瘤胃菌群与代谢的影响,本试验选择了 10头年龄、胎次相同,预产期相近的围产期奶牛作为实验对象,随机分成对照组与甾醇处理组,每组5头。处理组在饲喂牧场原有日粮的基础上添加200mg/d植物甾醇,甾醇为试验一中筛选出的B甾醇,试验从产前三周持续到产后三周,共六周,在生产前三周,生产前以及产后第三周分别采集瘤胃液,使用GC-TOF-MS分析系统测定瘤胃液代谢组,实时定量PCR和基于16S rRNA基因高通量测序检测分析瘤胃液菌群数量和结构的变化。结果发现:添加植物甾醇组瘤胃微生物蛋白浓度显著升高（P<0.05）;总挥发性脂肪酸在产后显著增加（P<0.05）;丙酸占比有上升的趋势（0.05<P<0.1）。代谢组检测发现,围产期奶牛瘤胃内容物样品中共检测到282种代谢物,其中差异代谢物27种。添加植物甾醇可以显著增加瘤胃内丙酮酸的相对含量（P<0.05）;显著降低酪胺和羟胺等代谢物的相对含量（P<0.05）。菌群定量结果显示,添加植物甾醇显著增加了产后瘤胃总菌数量（P<0.05）。高通量测序结果表明,两组瘤胃液菌群α-多样性指数没有显著差异（P>0.05）。围产期奶牛瘤胃优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）;优势菌属为普雷沃氏菌属（Prevotella）和琥珀酸菌属（Succiniclasticum）。试验结束时,添加植物甾醇显著降低了脱硫弧菌属（Desulfovibrio）与假丁酸弧菌属（Pseudobutyrivibrio）的相对丰度（P<0.05）;显著增加了硫胺素（Thiamine metabolism）和生物素（Biotin metabolism）两条代谢通路（P<0.05）。试验表明,围产期奶牛饲料中添加植物甾醇可以提高瘤胃内微生物数量,促进瘤胃微生物发酵;奶牛瘤胃中存在固有的核心菌群,部分菌群可以随日粮和机体变化而变化,整体较为稳定。3植物甾醇对围产期奶牛粪便微生物菌群与代谢的影响试验动物与设计同试验二,在生产前三周,生产前以及产后第三周分别收集新鲜粪便,测定其微生物菌群数量与结构及代谢物组成,测定方法同第二章。结果发现:添加植物甾醇对奶牛粪便pH、乳酸、氨态氮、微生物蛋白以及挥发性脂肪酸浓度无显著影响（P>0.05）。在奶牛粪便中共检测到282个代谢物,其中差异代谢物27种;添加植物甾醇显著降低了苏氨酸的相对含量（P<0.05）,显著增加了亚油酸、甘氨酸和戊二酸等26中代谢产物的相对含量（P<0.05）。试验结束时,添加植物甾醇对粪便总菌数量无显著影响（P>0.05）。高通量测序结果表明,两组粪便菌群α-多样性无显著差异（P>0.05）。在属水平上,70%粪便微生物为未分类鉴定菌属;试验结束时,添加植物甾醇显著增加了帕拉普氏菌属（Paraprevotella）、梭菌属（Clostridium）、粪球菌属（Coprococcus）与瘤胃球菌属（Ruminococcus）的相对丰度（P<0.05）;显著降低了甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、5-7N15菌属（5-7N15）、YRC22菌属（YRC22）与考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）的相对丰度（P<0.05）。在代谢通路方面,添加植物甾醇显著提升了半乳糖代谢（Galactose metabolism）（P<0.05）,降低了染色体（Chromosome）以及核糖体合成（Ribosome Biogenesis）等通路的代谢（P<0.05）。试验结果表明,围产期奶牛日粮中添加植物甾醇没有改变粪便微生物的总数量,但改变了其菌群结构与代谢通路。根据上述试验,添加一定量的植物甾醇可以提高体外发酵微生物产气量及挥发性脂肪酸产量,同时降低乳酸产量。植物甾醇的添加量比甾醇组分对瘤胃发酵影响更大。添加植物甾醇B,添加量为0.03 μg/mL对瘤胃发酵的促进作用最明显。而在围产期奶牛日粮中添加植物甾醇则可以显著提高瘤胃微生物数量,促进瘤胃发酵与微生物代谢,但对瘤胃微生物菌群组成没有显著影响。对奶牛粪便微生物代谢终产物没有显著影响,但显著改变了粪便微生物菌群结构、及其营养物质代谢通路。本试验为实际生产中使用植物甾醇代替抗生素来改善围产期奶牛营养状况提供了 一定理论数据与实践指导。