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卵巢上皮性癌病理类型复杂,包括浆液性癌、子宫内膜样癌及粘液性癌三种主要亚型,具有早期症状隐匿,易于转移和广泛播散的生物学行为,超过70%的患者就诊时已属晚期,预后极差,是死亡率第一的妇科恶性肿瘤,卵巢上皮性癌的发生机制至今尚不清楚。因此,寻找与其发生、发展密切相关的基因,阻断其发生过程中的关键环节具有重要意义。microRNAs（miRNAs）是一类长度约20～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,通过与靶mRNA 3’端非编码区（3’ untranslational region,3’UTR）形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）,在转录后翻译水平抑制靶基因的表达。近年来发现miRNAs能够调控某些致癌基因和抑癌基因的表达而影响细胞增殖、凋亡和迁移等。miR-135家族编码三个miRNAs定位于染色体3p21.1、12q23.1、1q32.1。miR-135a是miR-135家族的重要成员之一,在霍奇金淋巴瘤、结肠癌等多种肿瘤发生、发展中发挥重要的调控作用,但在卵巢上皮性癌中的作用机制国内外至今尚无报道。DNA甲基化改变在各种肿瘤包括卵巢上皮性癌发生过程中起重要作用。DNA甲基化所致基因失表达及低甲基化所致的基因表达增强是表观遗传学上研究最深入的机制,现已证实基因启动子异常甲基化与肿瘤发生关系密切,基因启动子区CpG岛甲基化可影响转录因子与其识别序列结合,直接抑制基因表达。研究发现HOXA10在子宫内膜癌中表达下调与HOXA10启动子甲基化有关,且HOXA10在子宫内膜发育、胚胎种植及乳腺癌发生过程中受雌激素调节并发挥重要作用。因此,设想HOXA10在卵巢上皮性癌中高表达,可能与雌激素诱导HOXA10甲基化状态改变有关。本研究旨在检测miR-135a在卵巢上皮性癌中的表达,应用生物信息学技术预测miR-135a高度相关的靶基因,通过化学合成miR-135a mimics和inhibitor进行功能获得性、缺失性研究,探讨miR-135a对其潜在靶基因的调控作用及对细胞增殖、凋亡的影响。观察17-β雌二醇对HOXA10表达及其启动子区甲基化状态的影响。研究miR-135a及17-β雌二醇在卵巢上皮性癌中的作用,可望进一步阐明卵巢上皮性癌的发生机制,为寻找卵巢上皮性癌的生物靶向治疗提供依据。第一部分miR-135a在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义目的检测卵巢上皮性癌组织中miR-135a的表达,分析miR-135a异常表达与卵巢上皮性癌临床病理特征间的关系,初步探讨miR-135a与卵巢上皮性癌发生的相关性。方法运用RT-PCR、Real-Time PCR法检测73例卵巢上皮性癌及55例正常卵巢组织中miR-135a表达量。结果miR-135a在卵巢上皮性癌中表达降低（P < 0.01）,且随着FIGO分期、组织学分期增加而下降;miR-135a高表达卵巢上皮性癌患者（15+9.47m）较miR-135a低表达卵巢上皮性癌患者（9.32+4.85m）具有更长的无疾病进展生存期（P = 0.04）;但miR-135a表达高低与CA125水平、淋巴结转移、残余肿瘤大小等无显著性相关（P > 0.05）。结论卵巢上皮性癌组织中miR-135a表达降低,miR-135a表达水平与卵巢上皮性癌患者FIGO分期、组织学分期及患者无病生存期密切相关。提示miR-135a表达的降低可能与卵巢上皮性癌的发生、发展密切相关,其在卵巢上皮性癌中发挥抑癌作用。第二部分miR-135a对卵巢上皮性癌细胞株中HOXA10调控作用及细胞生物学行为的影响目的研究miR-135a对其潜在靶基因的调控作用及对卵巢上皮性癌细胞株（SKOV3、HEY、OVCAR3）增殖、凋亡的影响。方法1.通过生物信息学技术预测miR-135a的靶基因,得出与miR-135a高度相关的靶基因:HOXA10。2.将成熟的miR-135a mimics、miR-135a inhibitor及相应的阴性对照分别转染卵巢上皮性癌细胞株,应用RT-PCR、Real-Time PCR和Western Blotting方法检测转染细胞中不同时间段HOXA10基因和蛋白水平表达的改变。3.构建HOXA10 3’UTR荧光素酶载体pMIR-REPORT Luciferase-HOXA10。4.报告基因实验:将pMIR-REPORT Luciferase-HOXA10、β-gal质粒、PLemiR-135a或Non-silencing lentiviral miRNA control质粒共转染具有高转染效率的293T细胞,48h后测定荧光素酶活性。5.应用四唑盐比色试验（MTT）、Western Blotting、Caspase-3检测试剂盒检测转染细胞中不同时间段细胞增殖水平、Bcl-2、Caspase-3表达水平。结果1.RT-PCR结果显示:miR-135a mimics转染24h后,对卵巢上皮性癌细胞株中HOXA10 mRNA的表达无明显作用,而48h及72h后,显著抑制HOXA10 mRNA的表达。Real-Time PCR的结果与RT-PCR的结果一致,除作用24h后无明显抑制作用外（P > 0.05）,转染后48h和72h,HOXA10的表达与对照相比显著降低（P < 0.05）。Western Blotting进一步验证了该效应。2.SKOV3、HEY、OVCAR3细胞转染miR-135a inhibitor及inhibitor的阴性对照后,结果与miR-135a增强表达完全相反（P < 0.05）。3.报告基因实验结果显示:与Non-silencing lentiviral miRNA control质粒相比,PLemiR-135a质粒与pMIR-REPORT Luciferase-HOXA10重组质粒共转染可使细胞的荧光素酶活性下降约67.8%（P < 0.01）。4.MTT实验结果显示:与对照相比,SKOV3、HEY、OVCAR3分别转染miR-135a mimics 48h和72h后490nm波长处光吸收值明显减低（P < 0.05）,但转染后24h细胞增殖活性并没有差异（P > 0.05）;细胞转染miR-135a inhibitor 72h后相对增殖活性显著提高（P < 0.003）,但转染后前两天细胞增殖活性没有明显的变化（P > 0.05）。5.细胞转染miR-135a mimics后,Caspaes-3的表达明显增加（P < 0.05）伴随着Bcl-2相应表达量的下降;转染miR-135a inhibitor后Caspaes-3的表达明显降低（P < 0.05）伴随着Bcl-2表达的相应增加,但影响不如miR-135a mimics显著。结论miR-135a通过HOXA10 3’UTR区直接抑制HOXA10的表达,从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。目的探讨17-β雌二醇（17-βE2）对人卵巢癌细胞株SKOV3中HOXA10基因表达及基因启动子区CpG岛DNA甲基化的影响。方法1.体外培养SKOV3,按实验目的分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L的17-βE2培养48h后,收集细胞,采用Real-Time PCR和Western Blotting检测HOXA10 mRNA和蛋白表达水平的变化。2.提取细胞基因组DNA,纯化、修饰后用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测HOXA10基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。结果1.与对照组相比,不同浓度的17-βE2可显著提高SKOV3细胞中HOXA10基因mRNA和蛋白表达（P < 0.05）。2.17-βE2作用后HOXA10基因呈部分甲基化状态。结论17-βE2可以逆转SKOV3细胞中HOXA10基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态,使HOXA10基因的表达上调。