【摘 要】
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人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球导致非细菌性急性肠胃炎的最主要病原体之一。目前,HuNoVs没有稳定的培养体系,其检测主要依赖于分子检测方法。因环境和食品样
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人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球导致非细菌性急性肠胃炎的最主要病原体之一。目前,HuNoVs没有稳定的培养体系,其检测主要依赖于分子检测方法。因环境和食品样品中病毒滴度低,如何高效富集病毒颗粒是HuNoVs检测的最大瓶颈。特异性抗体筛选及制备费时费力,且不易保存。核酸适配体可以特异性识别并捕获特定目标分子,是HuNoVs富集的新选择。适配体是通过指数富集的配基系统进化技术筛选得到的一段核酸片段。但是,传统的筛选体系操作复杂且对技术人员与设备要求高。基于此,本研究开发了一种以蛋白为靶标的核酸适配体筛选与二代测序技术相结合的新技术。主要流程是:将HuNoVs GII.4型衣壳蛋白P结构域包被于酶标板,与随机序列文库孵育;未结合的序列可以通过简单的洗涤而去除,之后孔内添加试剂对捕获序列进行PCR扩增;经过酶切的扩增产物,即可作为下一轮筛选的子文库。经过15轮筛选后,将最终文库进行二代测序,共获得30,622,226条序列。经分析后,最终获得了两条适配体,命名为APTL-1和APTL-6。用5份HuNoVs样本,对本项目筛选的适配体、文献报道的适配体APTM6-2,以及病毒受体HBGAs进行特异性捕获的比较试验。结果显示:本项目所获得的适配体亲和性较好,可结合原位捕获体系用于HuNoVs的检测。另外,在特异性识别并捕获病毒颗粒方面,适配体APTL-1与PGM无显著性差异(p>0.05),且优于前人所报道的APTM6-2。本项目的研究结果为环境和食品中HuNoVs富集与检测奠定了基础。
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