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由核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary]引起的油菜菌核病,是我国油菜生产中的首要病害,在长江流域油菜种植区尤为严重。近年来,油菜菌核病的发生呈逐年加重的趋势,带来的经济损失也逐年上升。油菜菌核病的控制大多以杀菌剂为中心,但是,传统的喷雾防治方法与效果并不能令人满意,因而当前防治油菜菌核病的重点在于发展一种基于环境监测和病害风险评估的病害控制策略,特别是油菜菌核病发病早期的检测、监测技术。因此,建立一种快速、灵敏、准确的分子诊断和检验技术体系,实现对实现对油菜菌核病发病早期的快速检测,为生产上及时有效地防治病害及减少损失提供技术和方法具有重大意义。
本研究利用核盘菌ITS序列,设计合成引物(XJJ21/XJJ222),构建油菜菌核病的快速、灵敏、准确的早期诊断技术体系,应用检测体系检测田间油菜菌核病,实现油菜菌核病早期分子诊断技术的应用。研究主要结果如下:
1.设计合成引物(XJJ21/XJJ222),进行引物特异性和灵敏度检验。结果表明,引物能特异性地扩增核盘菌DNA(片段大小为292bp),能较好地把核盘菌和其他供试病原菌区分开来。引物具有较高的灵敏度,能够扩增的最低浓度为0.01pg/μl核盘菌DNA。
2.用不同子囊孢子浓度接种油菜花瓣,在不同时间点取样的检测。检测结果表明,检测到核盘菌的最低子囊孢子浓度为102个/ml,培养时间为8h;检测到核盘菌的最短培养时间为2h,子囊孢子浓度为107个/ml;核盘菌子囊孢子浓度在102个/ml-107个/ml时,随着接种的子囊孢子浓度的增加,检测率增加,检测到的核盘菌DNA所需时间越短。
3.田间油菜花朵带菌率检测及其与病害发生的相关性分析。湖北省黄冈市两种类型田(棉花-油菜田和水稻-油菜田)两年(2009年和2010年)的花朵带菌率检测结果表明,始花期花朵带菌率分别为10%、7%和4%、2%,随着时间的延长,花朵带菌率增加,在盛花期达到高峰,花朵带菌率分别为41%、35%和27%、25%,终花期花朵带菌率分别为15%、11%和13%、11%。湖北省武穴市两种类型田(棉花-油菜田和水稻-油菜田)两年(2009年和2010年)的花朵带菌率检测结果表明,初花期花朵带菌率分别为8%、5%和2%、0,随着时间的延长,花朵带菌率增加,在盛花期达到高峰,花朵带菌率分别为36%、32%和25%、21%,终花期花朵带菌率分别为11%、10%和13%、10%。
两年(2009年和2010年)的油菜始花期花朵带菌率的检测和油菜菌核病病害调查结果表明,棉花-油菜田始花期花朵带菌率、叶发病率和茎发病率比水稻-油菜田高;同一类型油菜田在不同地区始花期花朵带菌率、叶发病率、茎发病率稍有差异。回归分析结果表明,叶发病率(Y1)、茎发病率(Y2)、与始花期花朵带菌率(X)都存在显著的相关性(P<0.05)。两年的叶发病率(Y1)与始花期花朵带菌率(X)的关系分别为:Y1=0.8923X+0.1326(R2=0.8824)和Y1=2.95X+20.875(R2=0.9086);两年的茎病株率(Y2)与始花期花朵带菌率(X)关系分别为Y2=0.5476X-0.0071(R2=0.9689)和Y2=2X+9.5(R2=0.9143)。