【研究背景】　　肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，而我国的癌症负担不断增加，每年大约有160万人被诊断为癌症，约120万人死于癌症。乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一，它发病率高，死亡率高。全球乳腺癌的发病率自20世纪70年代以来一直呈现逐年上升的趋势，而且近年来发病年龄趋于年轻化。但是随着现代医疗技术的不断提高，近年来乳腺癌的五年生存率有了很大的提高，但是有远处转移的患者的愈后仍然很差，五年生存率大约为20%。每年大约有30%的乳腺癌患者发生远处转移，其中有70%左右都是骨转移。侵袭性生长和远处转移是乳腺癌患者死亡的最主要的原因。尽管，目前的研究成果有利于我们进一步了解乳腺癌的发生发展，但是仍然有很多尚未发现的标记物阻碍了我们对乳腺癌发生发展的全面认识。　　越来越多的研究表明，microRNA在癌症的诊断和治疗中发挥着重要的作用，在乳腺癌中已经发现了几十种可以影响肿瘤生长转移的microRNA。miRNA是一类长度约20~24个核苷酸的非编码小RNA，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。它们通过与靶基因的mRNA3‘UTR区结合，抑制蛋白质的合成或直接降解靶mRNA,从而调控基因的表达。目前，只有一小部分的miRNA的生物学功能得到了阐明。　　miR-205是一种被证实的对肿瘤的侵袭转移有着重要负调控作用的抑癌基因，有研究报道miR-205在前列腺癌等肿瘤组织中低表达，而恢复miR-205在前列腺癌中的表达，可以导致间质样细胞向上皮样细胞转化。我们前期基因芯片分析发现，miR-205在乳腺癌细胞中低表达，于是我们想进一步研究它的生物学功能。　　肿瘤细胞的快速生长是实体瘤恶性进展的先决条件，其中会涉及到许多靶基因的表达异常和功能缺失。Runx2，又称核心结合因子，已有研究证明在多种恶性肿瘤中扮演者癌基因的功能。我们思考 miR-205-3p-3p的下降在乳腺癌进展中是否起到了促进作用？而这其中miR-205-3p-3p是否与Runx2有一定的联系呢？　　本课题中，首先检测了正常乳腺上皮细胞 MCF-10A和乳腺癌细胞 MB231、MCF7中miR-205-3p-3p的表达水平，人为改变miR-205-3p-3p的表达水平观察乳腺癌细胞在增殖、迁移侵袭以及克隆形成的变化；并通过生物信息学预测和荧光素酶报告基因来验证Runx2是否为miR-205-3p的靶基因。通过探讨miR-205-3p在乳腺癌细胞中的作用，为乳腺癌的临床诊断和治疗提供了新的方向。　　【研究目的】　　探讨miR-205-3p在乳腺癌细胞中的作用，寻找其靶基因。　　【研究内容】　　miR-205-3p在乳腺癌细胞株中的作用以及miR-205-3p与靶基因Runx2的预测和验证　　1.用qRT-PCR检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MB231、MCF-7中，miR-205-3p的表达情况。　　2.用慢病毒感染三株细胞，建立稳定表达miR-205-3p inhibitor/negative control的MCF-10A细胞株和稳定表达miR-205-3p mimic/negative control的MB231、MCF-7细胞株。　　3.用上述构建好的细胞株来研究miR-205-3p在乳腺癌细胞中的生物学功能。　　（1）MTT法检测细胞增殖能力的变化　　（2）平板克隆实验和软琼脂集落形成实验检测MB231和MCF-7的克隆形成能力和非锚定生长能力。　　（3）Transwell法检测MCF-10A、MB231和MCF-7中细胞侵袭能力的改变。　　4.用Western blot检测与EMT相关marker的蛋白表达情况。　　5.检测miR-205-3p是否通过Wnt/β-catenin介导EMT。　　6.用Targetscan软件预测miR-205-3p的靶基因Runx2，并用荧光素酶报告基因实验来验证。　　7.通过PCR和Western blot检测抑制或过表达miR-205-3p后Runx2的变化。　　【研究结果】　　1.与人正常乳腺上皮细胞 MCF-10A相比，miR-205-3p在乳腺癌细胞 MB231、MCF-7中低表达。　　2.成功构建了敲低 miR-205-3p的 MCF-10A和过表达 miR-205-3p的 MB231、MCF-7稳定细胞株。　　3. miR-205-3p对乳腺癌细胞增殖速度的影响：MTT结果显示，在MCF-10A中敲低miR-205-3p的表达后，细胞增殖速度明显增加；而在MB231和MCF-7中过表达miR-205-3p后，细胞的生长速度受到了抑制。　　4. miR-205-3p对乳腺癌细胞克隆形成能力和非锚定生长能力的影响：平板克隆结果显示，在MB231和MCF-7中过表达miR-205-3p后，克隆形成的大小和克隆形成率明显减少，软琼脂的集落形成大小和个数也都明显减少，表明 miR-205-3p抑制了乳腺癌细胞的克隆形成能力和非锚定生长能力。　　5. miR-205-3p对乳腺癌细胞侵袭能力的影响：Tranwell结果表明，在在MCF-10A中敲低miR-205-3p的表达后，细胞的侵袭能力增强；而在MB231和MCF-7中过表达miR-205-3p后，细胞的侵袭能力明显减弱。以上结果表明了miR-205-3p的升高能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。　　6. miR-205-3p与 MET的关系：细胞形态学观察发现，在 MB231中过表达miR-205-3p后，细胞间的连接变得紧密。通过WB检测发现，间质样Marker的表达降低，而上皮样Marker表达升高。　　7. miR-205-3p在乳腺癌细胞中可以通过Wnt/β-catenin信号通路逆转EMT的发生。　　8.生物信息学预测软件分析Runx2的mRNA3‘UTR区与miR-205-3p有一段完全互补的碱基序列；通过荧光素酶报告基因实验将 Runx2的野生型质粒与miR-205-3p mimic共转到293T细胞中，荧光强度与对照组相比显著降低，验证了Runx2是miR-205-3p的一个靶基因。　　9.过表达或抑制miR-205-3p在MB231和MCF-10A中的表达，Runx2的mRNA和蛋白水平相应的出现下降或上升。　　【结论】　　在乳腺癌细胞中过表达miR-205-3p，能够抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力，同时能够逆转EMT的发生，在乳腺癌中发挥着抑癌基因的作用。