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背景:间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是存在于成体组织器官中的一类干细胞,具有良好的自我更新能力,广泛存在于骨髓、脂肪、胎盘及脐带等组织中。在一定的条件下,间充质干细胞能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞、骨骼肌细胞及心肌细胞等。它们具有多向分化、调节免疫应答及支持骨髓造血等多种功能。鉴于这些重要功能,MSCs成为组织工程和临床细胞治疗的重要工具。MSCs具有免疫调节功能,在体内外能有效地抑制多种免疫细胞的活化,因此可以被用于预防和治疗炎性及免疫相关疾病,如移植排斥反应和自身免疫性疾病。但MSCs能否在细胞治疗中发挥作用还取决于细胞的活性及其功能状态。细胞生存的局部微环境对细胞的活性和功能至关重要。不同微环境对MSCs生物学功能具有不同的影响,如MSCs的免疫调节功能。近年来,对MSCs免疫调节功能的体内、外实验研究存在不同甚至相反的结果:MSCs除介导免疫抑制外,亦能促进炎症的发生和进展。因此,MSCs生存的微环境对其是否能维持正常生物学功能至关重要。细胞衰老是严重影响细胞活性和功能、降低细胞治疗效果的重要因素;而炎症是诱导细胞衰老的原因之一。那么,体内外的炎症微环境对MSCs的生物学功能会产生哪些影响?是否会诱导细胞衰老的发生?其机制是什么?第一部分炎症微环境对不同组织来源的间充质干细胞生物学功能和细胞衰老的影响及其机制目的:本课题拟以内毒素血症模型炎性血清为刺激因素,探讨其对体外培养的不同组织来源的正常MSCs生物学功能及细胞衰老的影响,并深入探讨其潜在分子机制。方法:1.选取体重100-250 g左右的健康、清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠,分离、培养骨髓来源的MSCs（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）和脂肪来源的MSCs（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）。利用流式细胞术（（Flow cytometry,FCM））检测细胞表面分子的表达,并通过成骨、成软骨和成脂分化诱导对培养细胞进行鉴定。选用第二代（Passage 2,P2）至第三代（Passage 3,P3）MSCs用于后续实验。2.建立大鼠内毒素血症模型。通过腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）（10 mg/kg）复制大鼠内毒素血症模型,腹腔注射相同体积磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）的大鼠作为对照组。24 h后心脏取血,分离血清。一部分血清用于通过ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-10、TGF-β和TNF-α;另一部分血清过滤除菌、灭活、分装后用于后续实验。同时,取大鼠的肝脏和肺组织,经多聚甲醛固定后行HE染色,观察各组织的病理学改变,以确定大鼠内毒素血症模型的建立是否成功。3.用内毒素血症模型血清（炎性血清）和对照组血清分别刺激培养的正常MSCs,通过Transwell细胞迁移实验,CCK8检测炎性或对照血清对MSCs增殖的影响,FCM检测炎性或对照血清对MSCs的细胞周期以及细胞凋亡的影响,探讨炎性血清对BMSCs和ADSCs的生物学功能的影响。4.分别通过β-半乳糖甘酶（β-Galactosidase,β-gal）染色、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）的检测和细胞周期抑制蛋白（p16、p21）检测探讨炎性血清对MSCs衰老的影响。5.通过FCM检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平和共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位（ΔΨm）,分析细胞衰老与细胞线粒体功能的联系。6.通过蛋白印迹（Western blot,WB）的方法检测炎性血清刺激的不同时间点（2 d、4 d、6 d）MSCs中Notch通路信号分子Notch1及其下游靶基因Hes1的表达水平。通过Notch信号通路的阻断剂DAPT阻断经典Notch1信号通路,检测其对MSCs的老化相关指标的影响,探讨Notch1在炎症微环境诱导MSCs衰老中的作用。7.通过WB检测炎性血清刺激后细胞老化相关蛋白Sirtuin 1（SIRT1）的表达水平;通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,co-IP）的方法检测Notch1与SIRT1的相互作用。进一步通过co-IP检测Notch1的乙酰化水平。8.通过WB的方法检测炎性血清刺激的不同时间点（2 d、4 d、6 d）MSCs中NF-κB和C/EBPβ的表达及活化水平。结果:1.通过贴壁筛选法培养的细胞,经过两次传代后显微镜下观察细胞形态似成纤维细胞样长梭形或纺锤形,呈旋涡状排列生长;细胞表面高表达CD29,CD90,低表达CD11b,CD45;经相应的分化培养基诱导培养后,细胞可分别分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。这些结果提示培养扩增的细胞为MSCs。2.LPS腹腔注射24 h后,模型组大鼠血清中的炎性因子IL-1β、IL-10、TGF-β和TNF-α的含量明显高于对照组,其组织切片HE染色显示肝脏和肺脏充血明显,肺间隔断裂,并有炎性细胞浸润。3.与对照血清相比,炎性血清刺激两种不同来源的MSCs后,MSCs的增殖能力显著降低,细胞周期被阻滞于G1期,迁移的细胞数量显著增高,但炎性血清对两种MSCs的凋亡水平均无明显影响。4.炎性血清处理后,MSCs中β-gal活性增高,SASP（IL-1α,IL-6,IFN-γ,MCP-1）水平升高,细胞周期相关蛋白（p16、p21）表达水平亦显著升高,表明炎性血清刺激可诱导MSCs衰老。5.炎性血清处理细胞后,MSCs胞内ROS水平显著升高,并且细胞的线粒体膜电位下降。6.随着炎性血清刺激时间的延长,MSCs上Notch1及其靶基因Hes1表达上调,DAPT处理阻断经典Notch信号通路能部分逆转炎性血清刺激对MSCs的影响,包括细胞增殖增快、细胞内β-gal活性降低、细胞SASP细胞因子分泌减少及p16、p21表达水平降低。7.炎性血清处理后,MSCs中SIRT1表达水平降低,与SIRT1结合的Notch1水平显著升高,Notch1乙酰化水平显著升高。8.炎性血清刺激后,MSCs中C/EBPβ表达增高,而NF-κB的表达无明显变化。结论:1.内毒素血症模型来源的炎性血清刺激显著影响不同组织来源正常MSCs的生物学功能,包括细胞增殖和迁移能力及细胞周期,并诱导MSCs的衰老。2.炎性血清可能通过抑制SIRT1蛋白表达和Notch1的去乙酰化,促进Notch1-C/EBPβ通路活化诱导MSCs衰老。第二部分体内炎症微环境对在体组织间充质干细胞生物学功能和细胞衰老的影响目的:探讨脓毒症性炎症环境对在体BMSCs生物学功能及细胞衰老的影响。方法:通过盲肠结扎穿孔术复制大鼠脓毒症模型,假手术组作为对照组。分离脓毒症大鼠和对照组大鼠的BMSCs并进行体外扩增培养,通过光镜和流式细胞仪观察其形态学变化;利用分化诱导液诱导BMSCs的分化并通过ELISA检测分化标记物评价BMSCs的分化能力;通过Transwell细胞迁移实验、CFU-F和CCK8检测BMSCs的增殖和迁移能力,探讨脓毒症炎症微环境对BMSCs的生物学功能的影响。分别通过β-gal染色、细胞周期抑制蛋白（p16、p21）和FCM检测BMSCs细胞周期以及细胞凋亡,检测探讨脓毒症炎症微环境对BMSCs衰老的影响结果:在体外培养系统中,与对照组BMSCs相比,脓毒血症大鼠来源的BMSCs胞体变小、变圆,细胞增殖和迁移能力降低,细胞周期被明显阻滞于G1期,且细胞周期抑制蛋白p16和p21表达增加,细胞中的β-gal活性增加;但细胞分化成骨、成软骨和成脂的能力不受影响。结论:炎症微环境可直接影响体内BMSCs的部分生物学功能,并使得BMSCs具有衰老趋势。