驼源单域抗体(VHH,纳米抗体)是一类仅由重链可变区组成的抗体片段。这类抗体片段具备很多结构和功能特点,例如分子量小、热稳定性强以及水溶性好等。与传统抗体相比,纳米抗体由于天然缺失Fc区从而能够在微生物系统中进行表达制备,能够大幅节省人力开支。当前,有多个表达系统可成功用于表达纳米抗体,包括原核细胞、酵母、丝状真菌、昆虫幼体、哺乳动物细胞以及植物组织等。尽管如此,在纳米抗体表达过程中仍然存在着很多难题,仍然需要其对表达系统和表达方法进行更为深入的优化探究。本文选择大肠杆菌为表达平台,以本实验室通过噬菌体展示技术从合成纳米抗体文库中筛选获得的纳米抗体序列VHH2为表达序列,应用三种大肠杆菌表达策略成功制备了纳米抗体VHH2。具体过程为:首先,通过周质表达的方式在大肠杆菌周质空间中积累纳米抗体,最终产量为3 mg/L。随后,选择胞内融合蛋白的表达形式,融合表达纳米抗体和二硫键异构酶DsbC,每升菌液可得到8 mg融合蛋白。再选择适合的酶切条件对其进行肠激酶酶切,可高效切割分离融合标签DsbC和目的蛋白VHH2。最后,选择了氧化型突变大肠杆菌作为表达宿主直接在胞内表达目的蛋白,之后经过简单的条件优化即可得到产量约17 mg/L的纳米抗体,为验证该方法的重复性和普适性,选择另外两条针对不同靶标的VHH序列进行同样的重组质粒构建和表达,均可成功获得各自的目的蛋白。在完成表达后,对实验获得的VHH2进行了Western-blot、ELIS A、qPCR、SPR、细胞ELISA和细胞免疫荧光检测等验证实验,证明了本实验制备的纳米抗体具有良好的抗原结合能力,热稳定性以及癌细胞识别能力。本文对比了大肠杆菌的三种纳米抗体表达策略。首次引入氧化型突变大肠杆菌TranB表达纳米抗体,在成功表达的同时其产量远优于传统的周质表达,对其他纳米抗体的表达具有一定指导意义。此外,本文通过融合表达氧化还原酶DsbC实现了纳米抗体在常规大肠杆菌胞内的高产量可溶性表达,对于DsbC和纳米抗体的可溶性以及空间结构之间作用关系的相关研究具有可借鉴意义。