硫是组成生命有机体的重要元素之一,在自然界中主要以硫化氢和硫酸盐的形式存在。硫化氢（H2S）作为一种气体信号分子可以参与生物体中的很多生理活动,先后有研究指出硫化氢在血管舒张、心脏保护、抵抗氧化应激、神经传递和抗炎症作用等过程中发挥重要作用。然而,过量的硫化物对细胞是有毒的,可以通过毒害细胞色素c氧化酶来抑制细胞呼吸或通过产生不同的活性硫物质来提高氧化应激。生物细胞可以自身调节胞内硫化物含量,把硫化氢的产生和去除维持在一个稳态。许多异养菌在利用有机物时产生硫化氢,硫化物:醌氧化还原酶（SQR）和黄素细胞色素c-硫化物脱氢酶（FCSDs）是生物去除硫化氢的两种主要酶,其中SQR参与的硫化氢氧化途径分布更广范。SQR在细菌中通常会与过硫化物双加氧酶（PDO）形成操纵子。SQR和PDO协同氧化硫化物的途径已在人的线粒体、Staphylococcus aureus和Cupriavidus.pinatubonesis JMP 1 34 中有深入研究。在这个途径中,SQR氧化硫化氢为零价硫,并以谷胱甘肽（GSH）或硫化氢为受体,生成不同形式的硫烷硫,PDO则将谷胱甘肽过硫化物（GSSH）氧化成亚硫酸盐,亚硫酸盐与零价硫自发反应产生硫代硫酸盐。硫氰酸酶（rhodanese,Rhod）也可能会参与到SQR-PDO硫化氢氧化过程中。Rhod最早以催化硫代硫酸盐与氰化物的反应而被定义,通过乒乓机制进行催化,其活性位点的半胱氨酸残基携带转移的硫形成共价中间体。除氰化物外,Rhod可以用GSH、亚硫酸盐、硫氧还蛋白作为硫的受体;除硫代硫酸盐外,多硫化物、GSSH均可作为硫的供体。人线粒体中的Rhod蛋白TSTD1优先催化硫烷从GSSH转移到亚硫酸盐产生GSH和硫代硫酸盐。在S.aureus中,PDO-Rhod融合蛋白CstB的Rhod结构域,也促进了硫代硫酸盐的形成。Burkholderia phytofirmans中PDO2-Rhod融合蛋白的Rhod结构域则催化硫代硫酸盐的硫烷转移生成GSSH和亚硫酸盐。虽然Rhod早在80多年前就被发现,有多种生理活性已被研究清楚。但是在不同的SQR-PDO硫化氢氧化途径中,关于Rhod的研究只停留在生化活性检测上,其具体的生理意义还没有很清楚的阐明。除此之外,Rhod分布广泛,在没有硫氧化通路的菌株中仍然大量存在,如大肠杆菌没有SQR-PDO途径,但是含有多达九个Rhod。在这些非硫化氢氧化途径中的Rhod,有一部分蛋白及同源结构域的功能已经得到揭示,包括参与形成铁硫簇、合成硫胺素及参与硒代谢等,但是很多未知功能的Rhod,在硫烷硫代谢中的作用仍有待于研究。硫烷硫在体内普遍存在,参与机体内氰化物的脱毒、维持氧化还原状态、信号调控等生理功能。硫烷硫的种类主要包括有机过硫化物（RSSH）和有机多硫化物（RSSnR,RSSnH,n≥2）,无机多硫化物（HSnH,n≥ 2）和单质硫（S8）。在体内硫烷硫和硫化氢是可以相互转化、共同存在的,但是硫烷硫相比于硫化氢更容易对蛋白进行过硫化修饰。因此,很多与硫化氢有关的生物活性被认为很大程度上可能是由硫烷硫介导的。目前,用于硫烷硫检测的方法有很多种,主要可以分为三类,一种是利用硫烷硫的亲核性或亲电性,通过化学反应将硫烷硫转化成一种较容易检测的化合物形式,这类方法的检测限一般较高,对于内源性硫烷硫的检测不够灵敏。此外,很多研究通过检测特定的荧光探针与硫烷硫反应后释放的荧光,进行活体生物细胞内硫烷检测,但是不能绝对定量。还有通过特定的方法结合质谱分析对巯基化修饰的蛋白上的硫烷进行检测,这类方法大都针对某些特定形式的硫烷硫,且操作复杂,检测成本较高,不适宜大量样本的检测。尽管硫烷硫的生理功能非常重要,但是迄今为止还没有一种特异性强、灵敏度高、能绝对定量生物体内总硫烷硫含量的方法。为解决上述问题,本文开发了一种快速灵敏的硫烷硫检测方法,并对生物样品中总硫烷的变化规律、Rhod在硫化氢和硫烷硫代谢中的生理功能进行了研究。主要研究内容如下:1.建立了一种简单灵敏的胞内总硫烷硫的检测方法。在pH=9.5的碱性缓冲液中,加入1%TritonX-100和50μMDTPA,95℃加热反应10 min处理生物样本,可以将胞内硫烷硫转化为稳定的硫代硫酸盐,通过高效液相色谱来进行检测定量。这种方法有利于细胞快速破裂,简单有效地对胞内硫烷进行检测。将硫烷硫通过转化为硫代硫酸盐检测的方法,可以特异性的对单质硫S8、无机多硫化物H2Sn、连四硫酸盐,有机过硫化物GSSH、Cys-SSH,有机多硫化物Ms-SSS-Me、Tsp-SSSS-Tsp中的硫烷硫进行检测,所有类型的硫烷几乎都完全转化形成硫代硫酸盐。通过将硫代硫酸盐与mBB衍生后经色谱检测,检测限可低至200 nM。本文应用该方法检测了细菌、酵母等微生物在不同生长阶段的胞内硫烷硫含量变化。微生物体内总硫烷含量在生长初期均呈增加趋势,在一段时间内保持稳定,在生长对数后期或衰退期急剧下降。本文还对哺乳动物细胞和斑马鱼的不同生长时期体内硫烷含量进行了检测。生长至贴壁状态的动物细胞更换新鲜培养基之后的一个阶段内,细胞的硫烷硫含量也是呈现先增加后降低的趋势。在斑马鱼从胚胎发育成幼鱼的过程中硫烷含量在逐渐增加,从幼鱼生长成成鱼的过程中硫烷的含量很低。此外,还对拟南芥、小鼠和中华对虾的不同器官中硫烷硫的含量进行了检测。所有样本都含有硫烷硫,其浓度在不同器官中均介于约1至10 nmol/mg（净重或蛋白）之间。因此,该方法适用于生物样品中总硫烷硫的定量分析。2.探究了C.pinatubonensis JMP1 34中融合蛋白SQR的Rhod结构域DUF442在硫化氢代谢途径中的生理意义。本课题组前期的研究通过将C.pinatubonensis JMP134的SQR-PDO硫化氢氧化途径在大肠杆菌中异源表达发现,CpSQR的Rhod结构域DUF442游离表达时,可以催化加速硫代硫酸盐和GSSH的生成。本文后续研究发现DUF442在CpSQR上融合表达时可以保护细胞免受氧化压力,维持细胞的氧化还原稳态。本文在原有SQR-PDO外源表达体系的基础上,调整了 CpSQR和CpPDO的相对表达量,并且敲除外源重组菌株大肠杆菌的八个Rhod,获得了一个排除背景菌株干扰、更加接近野生型C.pinatubonensis JMP134中SQR-PDO蛋白表达比例的优化的异源表达体系。在优化的条件下,发现融合在CpSQR上的DUF442结构域,可以抑制CpSQR氧化硫化氢的速率,减少了硫烷硫的积累。同时融合表达的DUF442结构域,还可以保护胞内GSH不被无效氧化,在没有CpPDO下游氧化通路的时候避免GSSH的过量生成,过量的GSSH会与GSH自发反应产生GSSG和硫化氢,生成的GSSG需要谷胱甘肽还原酶来还原,而硫化氢则重新进入SQR-PDO氧化途径,这样会形成一个无效的循环,DUF442结构域的存在避免了这一循环的进行和胞内还原力的浪费。CpPDO氧化过硫化物的产物亚硫酸盐,可以减轻DUF442对CpSQR氧化硫化氢活性的抑制。亚硫酸盐作为SQR-PDO途径中的一种终产物,其生成依赖于CpSQR对硫化氢的氧化,这就表明DUF442和亚硫酸盐共同作用,实现了对硫化氢氧化速率和最终产物生成的动态控制,避免了不必要的硫烷积累,对细胞造成氧化压力。与CpSQR相融合表达的DUF442结构域与游离表达的DUF442具有不同的活性,尽管这两种形式的蛋白都可以避免硫烷硫形成。但是游离表达的DUF442可以通过硫氰酸酶的活性,催化硫烷加速形成GSSH和硫代硫酸盐,在CpPDO存在时协助CpPDO代谢GSSH,防止硫烷的累积。同时游离表达的DUF442在SQR-PDO途径的功能可以被大肠杆菌的GlpE和YgaP等具有硫氰酸酶活性的Rhod所取代。而融合表达的DUF442不具有硫氰酸酶的活性,通过减缓硫化氢氧化避免胞内硫烷累积,可以独立发挥作用,不依赖于CpPDO。3.探究了大肠杆菌的Rhod的生理功能。大肠杆菌作为一种模式微生物,胞内没有典型的SQR-PDO硫化氢氧化途径,但是却有多达九个Rhod。本文利用构建的大肠杆菌多个Rhod敲除菌株探究了 Rhod的生理功能。大肠杆菌的Rhod在帮助菌体抵抗氧化压力和渗透压方面也有一定的积极作用。同时Rhod在大肠杆菌的硫代硫酸盐代谢过程中具有一定的作用。当大肠杆菌主要的硫代硫酸盐代谢酶CysM缺失时,Rhod可以协同代谢硫代硫酸盐,可能通过将硫代硫酸盐的硫烷转移后生成亚硫酸盐供菌体利用。在CysM缺失的情况下,大肠杆菌的另一个半胱氨酸合成酶CysK呈现一定程度的上调,CysK通过利用亚硫酸盐还原产生的硫化氢进行半胱氨酸合成可能是菌体在无法正常代谢硫代硫酸盐合成半胱氨酸时的一种应急机制。