尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是人体中重要的药物代谢酶之一催化尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)与多种亲脂性底物结合,增加化合物的亲水性,有助于其排泄,是机体重要的解毒途径之一。UGT1A9和UGT2B7分别为UGT1A亚族和UGT2B亚族的重要成员,催化包括洛芬类非甾体抗炎药、白藜芦醇、SN-38等多种临床常用药物在体内的葡萄糖醛酸苷结合过程。随着现代医疗技术和分子生物学技术的发展,人们逐渐认识到药物代谢酶的基因多态性与药物在人体内存在明显个体差异代谢之间存在密切的关联,因此,对于药物代谢酶基因多态性的研究日益为研究者们所重视。药物不同的立体构型导致其在体内的代谢过程存在着一定的选择性,如手性药物的对映体选择性代谢等,当药物的药效主要来自于某种构型的异构体时,这种选择性代谢可能会导致其药效和毒性发生显著改变。目前,国内外关于药物代谢酶基因多态性对药物选择性代谢影响的研究非常少见。本文采用Bac-to-Bac杆状病毒感染的昆虫表达系统获得活性重组的UGT2B7和UGT1A9的野生型及各自的三种突变体蛋白。以此为模型,选择手性洛芬类药物和反式白藜芦醇(trans-RES)作为底物,进行了一系列的研究,从药物代谢酶的基因水平对遗传多态性中药物代谢的功能性差异及药物选择性代谢的机理进行了深入的探讨。1.重组UGT2B7s和UGT1A9s的表达体外表达的重组药物代谢酶目前已经成为药物体外代谢研究的一项非常重要的工具,可以有针对性地进行单一同工酶的代谢功能及机理研究,了解药物相互作用机制、考察手性药物在体内产生对映体选择性代谢的机理,指导相关的体内研究为药理学毒理学研究结果提供相应的解释和依据。重组表达技术使得在体外评价某种酶的多个突变体催化能力的改变成为可能。本实验应用重组杆状病毒感染昆虫细胞表达系统重组表达UGT2B7和UGT1A9野生型及各自的三种突变体,分别采用anti-UGT1A和anti-UGT2B抗体对表达的蛋白进行western blot鉴定,并以经典底物测定了表达成功的两种UGT的活性,由此得到的UGT2B7和UGT1A9重组酶可以用于后续的药物代谢研究。2.重组UGT2B7s对六种手性洛芬类药物代谢差异的研究洛芬类非甾体抗炎药(Non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)均具有一个手性中心,目前多数仍以消旋体给药。文献报导表明洛芬类药物在人体内通过葡萄糖醛酸结合的清除代谢多数表现出明显的立体选择性。两个对映体若以不同的反应速率进行葡萄糖醛酸结合反应,会导致其表现出有差别的药效和毒性行为。本实验主要考察了UGT2B7野生型及三种功能性突变体对六种洛芬类药物(卡洛芬：carprofen, CPF;非诺洛芬：fenoprofen, FePF;氟吡洛芬flurbiprofen, FPF;布洛芬：ibuprofen, IPF;酮洛芬ketoprofen, KPF;扎托洛芬zaltoprofen, ZPF)葡萄糖醛酸苷化代谢过程的差异以及突变体对这六种药物选择性代谢的影响。应用体外重组表达的UGT2B7野生型及三种突变体蛋白分别与六种洛芬类药物进行体外孵育试验。采用固相萃取的方法纯化洛芬单个葡萄糖醛酸苷,用β－葡萄糖醛酸苷水解酶进行水解后定量,以此为对照品建立洛芬单个葡萄糖醛酸苷的标准曲线,在已有文献研究的基础上应用已有的、改进的或新建的RP-HPLC法检测洛芬类药物及其葡萄糖醛酸苷,研究四种UGT2B7蛋白对六种洛芬类药物的代谢特征。实验结果表明：在所研究的六种手性底物中,UGT2B7对除了CPF外的药物的催化过程均符合Michaelis-Menten方程,而对CPF的代谢表现出非典型动力学特征。四种UGT2B7蛋白对洛芬类药物的催化活性顺序为*1>*71S(FePF除外)>*2>*5,其中*5几乎完全丧失了对洛芬类药物的催化活性。UGT2B7的三种突变体虽然各自表现出其对洛芬类底物代谢功能上的极大变化,但对除CPF外的洛芬类手性药物葡萄糖醛酸苷化代谢的对映体选择性几乎没有产生影响。3.重组UGTlA9s催化反式白藜芦醇和氟吡洛芬的代谢差异研究白藜芦醇(RES)是一种具有多酚结构的植物抗毒素,多存在于葡萄、虎杖、花生和红松等植物中,具有防治心脑血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化等药理活性。RES存在顺式和反式两种异构体,在自然界中主要以反式形式存在。RES在人体内主要经UGT1A1、1A6和1A9代谢为其葡萄糖醛酸苷,这种代谢过程表现出化学区域选择性,分别生成3-O-葡萄糖醛酸苷(R3G)和4’-O-葡萄糖醛酸苷(R4’G)两种代谢产物。已有报告明确了UGT1A1和UGT1A6的基因多态性对其代谢过程的影响,但UGT1A9的基因多态性对其代谢的影响尚不清楚。本实验主要研究UGT1A9的野生型及三种突变体蛋白对RES催化活性的差异。对于R3G生成的过程来说,其动力学符合底物抑制特征,其中*2与*1相比具有相似的Km值,却表现出了显著的Vmax值的增大,*3和*5与*1相比其Vmax值的变化不显著,但*3的Km值却显著增大。另外,Km值与Ki值之间的显著差异提示底物可能是相继结合到两个位点上的；对于R4’G的生成过程来说,符合非典型动力学特征(自身活化),*2与*1相比表现出Km值和Vmax值的显著增大,*3和*5与*1相比其Vmax值略有减小,但差异不显著,而Km值均显著增大。结合UGT2B7s对FPF的研究发现,UGT2B7s和UGT1A9s对FPF的对映体选择性代谢行为恰好是相反的UGT1A9*2对(+)-FPF的清除率几乎为*1的1.6倍,而对(-)-FPF的清除率则没有显著差异,因而使得*2对rac-FPF表现出了更加显著的对映体选择性代谢。*5也表现出了强于野生型的对映体选择性代谢,而*3则几乎完全丧失了对FPF的代谢能力,*1、*2和*5对两个对映体Vmax/Km值的比值(-)/(+)分别为0.6、0.3和0.4。