三羧酸循环是生物体普遍存在的一种产能方式，线粒体作为能量工厂正是依赖于三羧酸循环的效能。经典的三羧酸循环包括8步反应，由8种酶催化，分别是柠檬酸合酶(Citrate Synthase，CS)、顺乌头酸酶(Aconitase，ACO)、异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(2-Oxoglutarate DehydrogenaseComplex，OGDC)、琥珀酰辅酶A合成酶(Succinyl-CoA Synthetase，SCS)、琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase，SDH)、延胡索酸水合酶(Fumarase，FH)和苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase，MDH)。早期，人们对三羧酸循环的认识限于单一酶的作用，即每种酶仅催化一步反应。随着科学的发展，人们认识到连续反应的两种酶或多种酶可能存在相互作用的关系。通过提高每种酶的配比，可能提高酶的效率。早期的工作通过研究三羧酸循环酶与酶之间的相互作用以提高酶的活性，从而提高微生物发酵的效率，而缺乏在哺乳动物中对三羧酸循环蛋白相互作用的研究。在本课题中，我们利用免疫共沉淀结合质谱的方法在哺乳动物中探索三羧酸循环蛋白复合物的构成，首次发现哺乳动物三羧酸循环的8种酶能形成蛋白复合物，以ACO2-IDH2-MDH2-CS为核心蛋白复合物，并包含一些电子传递链(NDUFS1，ATP5B)、脂肪酸氧化(ACAA2)、氨基酸代谢(GOT2)和糖酵解的酶(GAPDH)。同时我们首次发现三羧酸循环具有组织特异性，且在扩张型心肌病中三羧酸循环复合物的结构发生明显的变化。　　第一章:FH与SDHA抗体制备　　为了研究三羧酸循环的蛋白复合物的结构，我们通过体外构建，原核克隆表达，蛋白纯化等分子生物学技术，表达和纯化了人源FH和琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基(succinate dehydrogenase complex,subunitA,flavoprotein variant,SDHA)的抗原，并制备了相应的抗体，用于免疫共沉淀和质谱实验。体外构建了pMAL-c5x/FH，pMAL-c5x/SDHA载体，经转化至大肠杆菌DE3感受态细胞中，表达并纯化了FH和SDHA抗原，通过免疫动物（小鼠和兔）获得抗血清，经IgG纯化获得抗体，通过免疫共沉淀，免疫印迹，免疫荧光等实验以检测抗体的功能，结果表明制备的FH和SDHA抗体具有免疫共沉淀，免疫印迹，免疫荧光等性能，且这两种人源蛋白制备的抗体能与多个物种的相应蛋白交叉反应，如人，大鼠，小鼠，猪。　　第二章三羧酸循环复合物的研究　　利用制备的FH和SDHA抗体，及ACO2，IDH2，MDH2，CS，DLST，SDHB等抗体探索三羧酸循环酶复合物的组成和八种酶的蛋白相互作用，以及电子传递链NDUFS1，ATP5B，氨基酸代谢GOT2，脂肪酸氧化ACAA2和糖分解GAPDH这些酶的蛋白相互作用。利用IP-MS技术研究三羧酸循环酶以及与它密切相关的电子传递链，脂肪酸氧化，氨基酸代谢和糖分解酶的蛋白相互作用，采用western blot验证相互作用，蛋白质凝胶过滤实验探索三羧酸循环蛋白复合物的大小及酶的分布，并利用生物信息学技术构建蛋白相互作用网络。结果表明三羧酸循环酶互相作用，彼此偶联，共同形成大的分子复合物，且以ACO2-IDH2-MDH2-CS为核心蛋白复合物。蛋白质凝胶过滤实验也证实这四种酶在体内形成复合物，NDUFS1，ATP5B，ACAA2，和GAPDH的IP-MS实验也证实它们与三羧酸循环酶形成复合物。　　第三章三羧酸循环复合物的组织特异性以及与扩张型心肌病的关系研究　　三羧酸循环复合物是具有功能的蛋白复合物，表现在不同的组织器官具有不一样的蛋白复合物。正常人与扩张型心肌病患者的线粒体结构差异显著，三羧酸循环复合物的组成有变化，并且中间产物的水平也表现出明显的差异。利用IP-MS技术研究FH相互作用蛋白在肝脏和心脏组织中的差异，和三羧酸循环酶在不同组织如脂肪和心脏中蛋白表达的差异，以及正常心脏和扩张型心肌病心脏三羧酸循环酶复合物的不同，并利用代谢组学技术探索三羧酸循环中间产物的变化。结果表明FH的相互作用蛋白在肝脏和心脏出现显著性差异，在肝脏中多是尿素循环相关的酶，而在心脏中则多是三羧酸循环的酶。扩张型心肌病患者心脏的三羧酸循环复合物的结构更为松散，相互之间连接不够紧密，可能是复合物受到破坏，特别是核心复合物的结构，与此同时三羧酸循环中间产物如延胡索酸，苹果酸的水平也明显下降。　　第四章维药两色金鸡菊的主要成分马里苷对胰岛素抵抗细胞的三羧酸循环复合物的影响　　两色金鸡菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）分布在我国湖北、广东、陕西，新疆等地，具有降血压，降血糖等作用。本研究探索两色金鸡菊的主要成分马里苷对高糖诱导的胰岛素抵抗的作用，并对三羧酸循环酶以及中间产物的影响。构建了高糖诱导的胰岛素抵抗细胞模型，给以马里苷处理，检测细胞的糖分解能力及三羧酸循环酶的mRNA，蛋白表达差异，以及利用代谢组学技术检测中间产物的变化。通过糖吸收，糖分解等指标表明成功构建了高糖诱导的胰岛素抵抗细胞模型，在模型组中，与糖异生相关的酶PEPCK，G6Pase和三羧酸循环酶明显上调，且糖分解和三羧酸循环中间产物的代谢紊乱。而加入马里苷处理的细胞通过抑制糖异生酶和三羧酸循环酶的过量表达明显改善了代谢紊乱的症状。