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茎是高等植物的重要器官之一,马铃薯匍匐茎及块茎是茎的天然变异,揭示其发生机制,不仅对马铃薯茎器官发生、而且对以茎器官为收获对象的作物的相关研究具有重要的参考价值,然而,匍匐茎及块茎变异形成的分子机理及调控方式至今尚属未知。
本研究以不同成熟期马铃薯的匍匐茎和块茎RNA为材料,构建匍匐茎及块茎的消减cDNA文库,以期识别其形成特异表达基因,而后检测特异表达基因在不同基因型不同器官、发育阶段中表达,确定其表达分布特点,为最终揭示块茎发生分子机理奠定基础。主要研究结果如下:
1、以两基因型匍匐茎RNA为检测组(tester)或驱动组(driver)、块茎RNA为驱动组(driver)或检测组(tester),通过转录子消减杂交(TSH),构建了匍匐茎和块茎消减cDNA文库各2个,菌落观察统计及其后的检测结果显示,文库中重组率为95%左右,满足文库质量要求。
2、对文库进行菌落PCR筛选,随机挑取142个白色克隆分析发现117个为阳性结果,阳性率为82.4%,文库插入片段在100bp-1000bp之间;对42个阳性克隆进行了测序,序列经生物信息学分析,得到唯一非重复的EST序列21个。
3、经GenBank数据库blastx和blastn对21个EST进行了同源性比对,结果显示匍匐茎及块茎消减文库中,未识别且功能未知基因分别为26.7%和66.7%,已知功能基因涉及信号传导、转录调控、蛋白合成代谢、生物与非生物胁迫等过程。
4、RT-PCR分析明确了21 EST在马铃薯不同器官、不同发育阶段及不同基因型中表达分布,识别了6个器官特异EST且不同成熟期基因型及匍匐茎不同生长时期表达了不同的EST。研究结果不仅为揭示匍匐茎与块茎器官发生分子机理奠定了基础,也为其生育期相关研究识别了候选基因。