目的：人类颅脑及头面部肿瘤在进行放射治疗的同时难免会造成正常大脑组织及面部器官的辐射损伤。星形胶质细胞是大脑组织的最主要组成部分，本实验的目的在于研究Krüppel-like factor4(KLF4)在电离辐射致星形胶质细胞DNA损伤及其修复中所起的作用及其相应的机制，为中枢神经系统肿瘤的放射治疗及辐射防护提供新的思路和方法。KLF4在人体内是一个在多种组织中广泛表达的锌指结构转录因子，作为KLF因子家族的一员，KLF4在细胞分化和细胞周期调节中扮演非常重要的角色。根据靶基因的不同，KLF4既可以激活又可以抑制转录作用。目前已知的KLF4在细胞损伤中的作用为： DNA损伤激活抑癌基因p53，继而激活KLF4，KLF4通过激活或抑制下游基因如p21的表达显示出如调节G1/S期和G2/M期周期过渡等多重效应。此外，在特定的细胞微环境情况下，KLF4既可以作为肿瘤抑制因子也可以作为癌基因。Shuhei Matsuoka等人的工作表明，很多蛋白在DNA受到损伤后既参与周期阻滞又逆向参与DNA损伤及其重组修复，那么在中枢神经系统辐射损伤中KLF4既能调节星形胶质细胞G1/S期和G2/M期周期过渡，它有没有逆向参与星形胶质细胞DNA损伤或其修复的功能呢？也就是说KLF4在星形胶质细胞DNA损伤中扮演的角色究竟是损伤还是损伤修复？KLF4作为具有正性和负性转录作用的转录因子，在星形胶质细胞受到外界包括电离辐射等各种损伤因素恶变为星形细胞瘤时，或在星形胶质瘤进行放疗时，其所处正常星形胶质细胞和星形细胞瘤微环境的不同，KLF4在其中充当何种角色，它在星形胶质细胞DNA损伤修复过程中是作为转录激活因子还是转录抑制因子及其相应的分子机制尚不够清楚。我们对于KLF4因子不同功能间的转换，在正常星形胶质细胞的放射损伤中的作用及其相应的分子机制研究，将进一步为中枢神经系统肿瘤的发生机制和放射治疗的研究提供新的策略思路。方法：1我们利用小鼠大脑组织各种细胞贴壁能力的不同采用差速贴壁及振荡法原代培养昆明种新生小鼠大脑组织的星形胶质细胞并将其纯化，采用流式细胞仪鉴定星形胶质细胞的纯度。2给予星形胶质细胞4Gy X射线照射前后采用RT-PCR等方法测定其KLF4在照射前后不同时间点的表达并比较其差异,采用免疫荧光法测定其与γ-H2AX这一DNA损伤标志蛋白的表达的共定位程度。3使用慢病毒导入星形胶质细胞干扰其KLF4后，再给予相同剂量的电离辐射后，采用RT-PCR测定其KLF4mRNA在照射前后不同时间点的表达并比较其差异，采用彗星实验（comet）检测星形胶质细胞DNA损伤的程度在干扰前后的差异。4运用Western-blot方法，对比经慢病毒干扰KLF-4后的星形胶质细胞经过4GY电离辐射后与对照组之间，细胞对DNA损伤的两种主要修复方式（以DNA依赖蛋白激酶为主的非同源性末端连接修复和以ATM为主的同源重组）的主要基因即DNA损伤修复及肿瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白质印迹的差异。5在以上工作的基础上，我们做了初步的关于KLF4在脑胶质瘤中的表达的预实验，为下一步工作即KLF4在脑胶质瘤的发病机制中的作用做准备。我们收集了10例正常大脑、4例Ⅱ期脑胶质瘤、8例Ⅲ期脑胶质瘤、10例Ⅳ期脑胶质瘤cDNA，比较了其KLF4mRNA表达。结果：1.采用分离纯化原代培养昆明种小鼠的大脑星形胶质细胞，选择GFAP作为细胞鉴定的表面标记抗原，获得的星形胶质细胞纯度达90%以上，且细胞数量满足实验需要。2.给予昆明种小鼠原代星形胶质细胞4Gy X射线照射后，通过免疫荧光检测发现KLF4的表达与γ-H2AX的表达不仅在核中有90%的共定位，而且随时间的延长，表达强度变化趋势一致。3.原代培养的星形胶质细胞经慢病毒干扰KLF4基因后，经过4Gy X射线照射后，RT-PCR检测发现其γ-H2AX的mRNA值降低，采用中性彗星实验(neutralcomet)尾矩显著减小而碱性彗星实验（alkaline comet）尾距显著增长。4.运用Western-blot方法发现，经慢病毒干扰KLF-4后的星形胶质细胞经过4GY电离辐射后与对照组相比，细胞对DNA损伤的两种主要修复方式（以DNA依赖蛋白激酶为主的非同源性末端连接修复和以ATM为主的同源重组）的主要基因即DNA损伤修复及肿瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白质印迹均明显增强。此结果证实：Klf4抑制了电离辐射引起的DNA双链断裂损伤修复，是通过抑制细胞对DNA损伤的两种主要修复方式的主要基因即DNA损伤修复及肿瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs来实现的，干扰KLF-4后，星形胶质细胞经电离辐射后DNA损伤的两种修复方式的主要作用基因ATM和DNA-PKCs的损伤修复及肿瘤抑制作用将明显加强。5.比较了正常大脑及各期脑胶质瘤Klf4mRNA表达，结果显示KLF4随脑胶质瘤恶性程度的增加表达也增加，呈显著正相关。结论：我们的实验结果表明KLF4这一基因在中枢神经系统辐射损伤及修复中对星形胶质细胞DNA双链断裂的作用为损伤作用，而对星形胶质细胞DNA单链断裂的作用为损伤修复作用，与已报道的其对纤维原细胞的作用不同，表明KLF4在不同细胞环境中以及在不同的DNA损伤类型及其修复中扮演了不同的角色。实验还证实了KLF4抑制电离辐射引起的DNA双链断裂损伤的修复，是通过抑制细胞对DNA损伤的两种主要修复方式的主要基因即DNA损伤修复及肿瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs来实现的。此外，KLF4与脑胶质瘤恶性程度有一定关联，呈正相关，为下一步工作即KLF4在脑胶质瘤中可能是一个癌基因做前期准备。意义：本课题的意义在于探索KLF4在中枢神经电离辐射中星形胶质细胞的作用及其机制，为中枢神经系统肿瘤的放射治疗所致的正常组织的辐射损伤及其修复提供理论指导。