目的:通过制造EAT大鼠肝郁脾虚病证结合模型并给予软坚消瘿颗粒进行干预,观察应用软坚消瘿颗粒后EAT肝郁脾虚证大鼠的一般状态、客观指标、甲状腺功能及甲状腺自身抗体TGAb、TPOAb水平改变来评价疗效,并探讨桥本甲状腺炎肝郁脾虚证的病机实质;通过观察软坚消瘿颗粒对EAT肝郁脾虚证大鼠代谢组学改变,寻找桥本甲状腺炎特征性代谢产物及代谢通路,分析代谢产物及代谢通路变化规律,探讨软坚消瘿颗粒疗效机理。通过观察软坚消瘿颗粒对EAT肝郁脾虚证大鼠肠道菌群的改变,寻找桥本甲状腺炎菌群特点,分析各组肠道特有菌群及菌群的变化,探讨软坚消瘿颗粒疗效机理。材料与方法:首先该实验选取SPF级SD雌性大鼠48只,体重为200±20g,适应性喂养1周后,将大鼠随机分为正常组12只,模型组36只,正常组大鼠不予任何施加因素干预。其余大鼠采用高碘饮水喂养联合皮下注射甲状腺球蛋白共同建立桥本甲状腺炎大鼠模型,并应用“慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节”等方法制造肝郁脾虚模型,造模8周后,采用球后静脉丛穿刺方式取各组大鼠全血2 ml,用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠血清中甲状腺功能及甲状腺自身抗体TGAb、TPOAb含量,评价桥本甲状腺炎模型造模是否成功。观察大鼠的一般状态,以及毛色、摄食量、体重、粪便含水量、旷场实验等,比较各组之间的差异,评价肝郁脾虚模型造模是否成功。剔除不成模大鼠,剩余成模大鼠随机分成三组,其中正常组（9只）、模型组（9只）、软坚消瘿组（9只）、阳性对照组（9只）。大鼠给药剂量根据人与大鼠的体表面积等效剂量换算方法进行计算。正常组大鼠与模型组大鼠给予2ml蒸馏水灌胃,每日两次,连续干预12周;阳性对照组大鼠按照0.45g/kg·d-1的剂量给予金水宝水溶液经口灌胃,连续12周;软坚消瘿颗粒组大鼠按照12.96g/kg·d-1的生药量给予软坚消瘿颗粒经口灌胃,连续12周。治疗12周后,观察大鼠毛色、状态、进食情况、体重增长、粪便性状、旷场实验表现等,并取大鼠血清、粪便检测相关指标。采用ELISA法检测各组大鼠血清中甲状腺功能及甲状腺自身抗体FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平;用LC-MS（液相色谱-串联质谱法）检测各组大鼠血清中代谢组学的变化,原始数据经Proteo Wizard转换成mz XML格式,然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（＜25 ppm）和二级谱图匹配的方式,检索实验室自建数据库。数据经Pareto-scaling预处理后,进行多维统计分析。通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）验证模型稳定性,Hotellings T2分析判断数据真实可靠性,分析各组差异性代谢产物和差异性代谢通路来推测软坚消瘿颗粒的疗效机制;采用16Sr DNA高通量测序技术检测粪便样本,根据扩增的16S区域特点,基于测序平台利用双末端测序（Paired-End）的方法,构建小片段文库并进行双末端测序。通过对Reads拼接过滤、OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类、物种注释及丰度分析可以揭示样品物种构成,挖掘样品之间的差异,筛选差异菌群,进一步探讨软坚消瘿颗粒的疗效机制,分析实验数据为疏肝健脾法治疗桥本甲状腺炎提供新的思路和理论依据。结果:1.模型评价:与正常组比较,模型组大鼠FT3、FT4无统计学差异,TSH明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,血清甲状腺抗体TGAb、TPOAb水平均显著升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与正常组比较,模型组大鼠摄食量明显减少、体重增长率明显减少、旷场实验中运动总距离和中央区穿格数明显减少,粪便含水量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。正常组大鼠外观行为等表现未见异常。模型组大鼠出现肝郁脾虚症状,毛色暗沉粗糙无光泽,造模初期暴躁易怒,对束缚刺激反应强烈,挣扎反抗,束缚解除后迅速躲避、背毛竖立。造模后期对外界刺激反应迟缓,挣扎反抗减弱,持续时间明显减少,喜聚集,活动减少,扎堆拱背,摄食量减少,体重增长缓慢,甚至偶有便溏。从主观及客观指标等多方面变化,说明EAT肝郁脾虚大鼠模型造模成功。2.疗效评价:经过药物的干预治疗后,与模型组大鼠相比,软坚消瘿组FT3、FT4无明显统计学差异（P＞0.05）,TSH回升并向正常组接近,差异具有统计学意义（P＜0.01）,TGAb、TPOAb下降明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）,同时软坚消瘿组大鼠毛色稍有光泽,活动量增多,进食尚可,无便溏。说明软坚消瘿颗粒具有一定治疗作用。治疗后,与模型组相比,阳性对照组TSH回升,向正常组靠近,TGAb、TPOAb下降明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）,阳性对照组活动稍增多,大鼠便溏改善。说明金水宝胶囊具有一定治疗作用。软坚消瘿组与阳性对照组相比,TGAb、TPOAb差异无统计学意义（P＞0.05）,说明在该实验中软坚消瘿颗粒与金水宝两者疗效作用相当。3.从代谢组学变化角度探讨疗效机制:通过QC样本总离子流图（TIC）的结果显示,本次实验整个过程中由仪器误差引起的变异较小。通过总体样本主成分分析（PCA）显示,正、负离子模式下QC样本紧密聚集在一起,表明本项目实验的重复性较好。Hotellings T2分析显示,观察到样本绝大部分都处于99%的置信区间内,说明该实验样本数据基本可靠。与正常组相比,模型组共检测出甘露糖、牛磺酸、左旋肉碱等19种存在代谢组学差异的潜在生物标志物,主要涉及的代谢通路有癌症的中心碳代谢、ABC转运蛋白、蛋白质的代谢与吸收这三条。软坚消瘿颗粒与模型组相比,能够调节甘露糖、牛磺酸、左旋肉碱等17种差异代谢产物,并且对癌症的中心碳代谢、ABC转运蛋白、蛋白质是代谢与吸收等代谢通路具有显著回调作用。阳性对照组与模型组相比,能够调节邻氨基苯甲酸、乙酰肉碱、鞘磷脂等16种差异代谢产物。对蛋白质的代谢与吸收、ABC转运蛋白、氨酰-t RNA合成代谢这三条代谢通路有显著回调作用。软坚消瘿颗粒组与阳性对照组都能调节ABC转运蛋白通路以及异亮氨酸和苯丙氨酸含量,但对于其他代谢通路及差异性代谢产物,二者未发现共同作用机制,其作用机制有待进一步实验研究。4.从肠道菌群变化角度探讨疗效机制:与正常组相比,模型组的肠道菌群中,厚壁菌门增加,变形杆菌门减少,梭状芽胞杆菌纲升高,变形菌纲降低,梭菌目增加,假单胞菌目减少,莫拉菌科减少,瘤胃菌科增加,埃希菌属、类香味菌属数量减少,普雷沃菌属增多,大肠杆菌种减少。软坚消瘿颗粒可以调节模型组大鼠的厚壁菌门、变形杆菌门、梭状芽胞杆菌纲、变形菌纲、梭菌目、假单胞菌目、莫拉菌科、瘤胃菌科、埃希菌属、类香味菌属、普雷沃菌属、大肠杆菌种数量向正常组靠近。说明按照疏肝健脾法所应用的软坚消瘿颗粒对肠道菌群具有调节作用。金水宝对以上菌群无调节作用,考虑是通过其他机制来治疗肝郁脾虚桥本甲状腺炎,这也符合中医“同病异治”的理论。结论:1.高碘水联合免疫介导、慢性束缚、过度疲劳、饮食失节等成功建立EAT肝郁脾虚病证结合大鼠模型。2.EAT肝郁脾虚证大鼠甲状腺自身抗体显著升高,软坚消瘿颗粒可以降低甲状腺抗体,对该病起到治疗作用。金水宝也能降低甲状腺抗体,两者疗效相当。3.软坚消瘿颗粒可能通过调节甘露糖、牛磺酸、左旋肉碱等17种代谢产物和癌症的中心碳代谢、ABC转运蛋白、蛋白质代谢与吸收等代谢通路对桥本甲状腺炎肝郁脾虚证起到治疗作用。金水宝也可调节ABC转运蛋白通路以及异亮氨酸和苯丙氨酸等物质含量,但其余代谢产物及通路不同。4.软坚消瘿颗粒可能通过调节厚壁菌门、变形杆菌门、梭状芽胞杆菌纲、变形菌纲、梭菌目、假单胞菌目、莫拉菌科、瘤胃菌科、埃希菌属、类香味菌属、普雷沃菌属、大肠杆菌种数量从而调节肠道菌群失调,对桥本甲状腺炎起到治疗作用。未发现金水宝对以上菌群的调节作用,说明二者作用机制存在差异。