1目的1.1观察补肾化痰祛瘀方对Wilson病TX小鼠模型卵泡生长发育和卵巢局部因子BDNF的影响,并观察卵巢局部调控因子BDNF与卵泡细胞增殖及凋亡的相关性。1.2探讨补肾化痰祛瘀中药改善TX小鼠卵泡发育障碍与BDNF之间的关系,并阐述BDNF在卵泡细胞增殖及凋亡中的作用,为补肾化痰祛瘀中药治疗女性Wilson病伴有生殖系统异常症状的患者提供一定的实验依据。1.3探讨TX小鼠模型睾丸组织是否出现形态结构的破坏,并运用补肾化痰祛瘀方对其进行干预,明确补肾化痰祛瘀方对TX小鼠睾丸组织是否具有保护作用,为中医药治疗Wilson病男性患者合并生殖系统异常症状提供依据。2方法2.1基因型检测用7-10日龄SPF级C3He-ATP7b^tx-j小鼠脚趾提取基因组,取下样品组织进行纯化得出纯净DNA,根据相关引物对样品进行PCR扩增,根据实验步骤预变性,变性,退火,延伸,修复延伸得出扩增产物,将扩增产物进行切胶纯化回收,进行Sanger测序验证。2.2雌鼠实验研究75只SPF级C3He-ATP7b^tx-j雌性小鼠（001576）适应环境并进行喂养7天,随机数字法分为5组:空白组、Wilson病模型组、DMSA组、补肾化痰祛瘀方组及DMSA+补肾化痰祛瘀方组,每组平均15只。5组动物在每日早晨进行灌胃给药,以20ml药液/kg体重给与用药组,相同体积的生理盐水给与空白组与Wilson病模型组进行灌胃,每天灌胃1次,连续14天。灌胃结束后的第一天晨给全部小鼠腹腔注射PMSG,并于24小时后注射BrdU,48小时后注射hCG。运用HE染色法观察各级卵泡发育情况;通过电镜观察卵巢中颗粒细胞及卵泡细胞超微结构的改变;并运用免疫组化结合荧光及TUNEL法,分析BDNF与卵泡细胞增殖及凋亡的相关性。2.3雄鼠实验研究50只C3He-ATP7b^tx-j雄性小鼠（001576）,在SPF级环境下适应性喂养14天,按照随机数字法将小鼠分为5组:空白组、Wilson病模型组、DMSA组、补肾化痰祛瘀方组及DMSA+补肾化痰祛瘀方组,平均每组10只。以灌药量20ml药液/kg体重进行用药组的灌胃治疗,相同条件下予以等体积生理盐水对空白组与Wilson病模型组进行灌胃,每天进行1次,连续14天。灌胃周期结束后的第一天,用10%的水合氯醛麻醉小鼠,予以颈椎脱臼处死小鼠,然后进行取材。采用HE染色法观察小鼠睾丸组织形态结构的变化;通过电镜观察睾丸组织超微结构的改变;并运用免疫组化检测睾丸组织中3β-HSD的表达。3.结果3.1小鼠基因型检测结果运用Sanger测序法检测新生小鼠基因型,分别为野生型小鼠单峰图碱基G未突变,双峰图杂合型小鼠及纯和型小鼠碱基G突变为碱基A。3.2雌鼠实验研究结果3.2.1补肾化痰祛瘀方对TX小鼠卵泡发育的影响与空白组比较,Wilson病模型组小鼠卵巢组织中的正常次级卵泡及窦卵泡数目均出现明显的减少（P<0.01）,闭锁卵泡的数目增加显著（P<0.01）。与Wilson病模型组比较,DMSA组及补肾化痰祛瘀方组卵巢内正常次级卵泡及窦卵泡数目增加,而闭锁卵泡数目减少（P<0.01）。与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方组卵巢内正常次级卵泡及窦卵泡数目增加（P<0.01）,闭锁卵泡数目减少（P<0.05）,DMSA+补肾化痰祛瘀方组卵巢内正常次级卵泡及窦卵泡数目增加（P<0.01）,闭锁卵泡数目减少（P<0.01）。3.2.2补肾化痰祛瘀方对TX小鼠卵巢颗粒细胞及卵母细胞超微结构的影响与空白组相比,Wilson病模型组小鼠卵巢组织可见显著增多的异常变性空泡化的线粒体（P<0.01）。与Wilson病模型组小鼠相比,DMSA组及补肾化痰祛瘀方组卵巢组织中正常线粒体数目增加,异常变性及空泡化线粒体数目减少（P<0.05）,而DMSA+补肾化痰祛瘀方组卵巢内颗粒细胞凋亡现象减轻,正常线粒体数目增加,异常变性及空泡化线粒体数目减少（P<0.01）。与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方及DMSA+补肾化痰祛瘀方组卵巢内颗粒细胞凋亡现象均减轻,正常线粒体数目增加,异常变性及空泡化线粒体数目减少（P<0.05）。3.2.3补肾化痰祛瘀方对TX小鼠BDNF表达与卵泡细胞增殖相关性的影响与空白组比较,Wilson病模型组小鼠卵巢组织BDNF阳性表达量及卵泡内阳性增殖细胞平均光密度降低（P<0.01）。与Wilson病模型组比较,DMSA组及补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢组织BDNF阳性表达量及卵泡内阳性增殖细胞平均光密度增加（P<0.05）,DMSA+补肾化痰祛瘀方组两者平均光密度显著增高（P<0.01）。与DMSA组比较,DMSA+补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢组织BDNF阳性表达量及卵泡内阳性增殖细胞平均光密度增加（P<0.05）。3.2.4补肾化痰祛瘀方对TX小鼠BDNF表达与卵泡细胞凋亡相关性的影响与空白组比较,Wilson病模型组小鼠卵巢组织中凋亡细胞数量增加,BDNF蛋白表达量降低,平均光密度降低（P<0.01）。与Wilson病模型组小鼠比较,DMSA组及补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢组织凋亡颗粒细胞数量降低（P<0.01）,BDNF蛋白表达量增加（P<0.05）,DMSA+补肾化痰祛瘀方组凋亡细胞数量显著降低（P<0.01）,BDNF蛋白表达量增加（P<0.01）。与DMSA组比较,DMSA+补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢组织凋亡细胞数量显著减少（P<0.01）,BDNF蛋白表达量增加（P<0.05）。3.3雄鼠实验研究结果3.3.1补肾化痰祛瘀方对TX小鼠睾丸组织形态学的影响与空白组相比,Wilson病模型组小鼠睾丸组织JTBS评分显著降低（P<0.01）,曲细精管直径减小,但无统计学差异（P>0.05）。与Wilson病模型组比较,三组治疗组JTBS评分增加（P<0.05）,三组治疗组小鼠曲细精管直径稍有增大,但无统计学意义（P>0.05）;与DMSA组比较,DMSA+补肾化痰祛瘀方组JTBS评分增加（P>0.05）。3.3.2补肾化痰祛瘀方对TX小鼠睾丸组织精子细胞、间质细胞及支持细胞超微结构的影响小鼠睾丸组织精子细胞电镜超微结构显示空白组可见精子结构完整;Wilson病模型组显示异常的精子及线粒体,精子结构出现肿胀,周围可见空泡变性的线粒体结构;DMSA组及补肾化痰祛瘀方组,可见精子细胞结构正常,但周围仍存在轻度空泡状变性的线粒体结构;DMSA+补肾化痰祛瘀方组,可见精子排列整齐,空泡变性的线粒体较少。空白组间质细胞细胞核膜及线粒体结构的观察,可见核内染色质分布均匀,线粒体结构正常,可见管状嵴线粒体,无肿胀;Wilson病模型组显示了间质细胞线粒体数量减少,且可见大量空泡变性的线粒体,细胞核染色质出现边集现象;DMSA组显示了间质细胞结构可;补肾化痰祛瘀方组显示了少量溶酶体及线粒体结构有所恢复;DMSA+补肾化痰祛瘀方组显示了线粒体结构正常,细胞核染色质边集减轻,形态结构较模型组有明显改善。空白组支持细胞轮廓清晰,结构完整,细胞核质分布均匀,无核固缩及染色质集聚;Wilson病模型组显示了支持细胞结构遭到破坏,细胞核膜出现破坏,染色体集聚,核固缩;DMSA组,补肾化痰祛瘀方组,DMSA+补肾化痰祛瘀方组,三组支持细胞细胞核未见染色质集聚及核固缩,并可见正常线粒体结构。3.3.3补肾化痰祛瘀方对TX小鼠睾丸组织3β-HSD表达水平的影响与空白组比较,Wilson病模型组小鼠睾丸组织3β-HSD表达水平降低,平均光密度降低（P<0.01）。与Wilson病模型组比较,补肾化痰祛瘀方组,DMSA组以及DMSA+补肾化痰祛瘀方组3β-HSD表达水平增加,平均光密度增加（P<0.01）。与DMSA组比较,DMSA+补肾化痰祛瘀方组3β-HSD表达水平增加,平均光密度增加（P<0.05）。4结论4.1补肾化痰祛瘀方可改善Wilson病TX小鼠卵泡的发育;减轻颗粒及卵母细胞的结构破坏,减少异常线粒体数目,增加正常线粒体数目;4.2补肾化痰祛瘀方可增加Wilson病TX小鼠BDNF阳性细胞及增殖卵泡细胞数,表明BDNF与卵泡细胞增殖呈正相关,BDNF可影响卵泡细胞的增殖;4.3补肾化痰祛瘀方可增加Wilson病TX小鼠BDNF阳性细胞数,降低凋亡卵泡细胞数,表明BDNF与卵泡细胞凋亡呈负相关,BDNF可影响卵泡细胞凋亡;4.4补肾化痰祛瘀方可能通过调节BDNF的表达,进一步影响卵泡中颗粒细胞的增殖与凋亡,从而促进卵泡细胞的发育;4.5补肾化痰祛瘀方可减轻小鼠睾丸组织结构及其超微结构损害,其可能是通过增加睾丸组织中3β-HSD表达,进而促进精子发生。