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研究背景:肿瘤细胞来源的微颗粒（TMPs）是指肿瘤细胞在自然状态下或受到各种刺激后,细胞骨架发生改变,部分细胞膜向外膨胀,同时包裹细胞内生物活性物质（如核酸片段、蛋白质分子及脂质等）,通过出芽的方式释放到细胞外,典型的TMPs呈囊泡状结构,直径约100～1000 nm。TMPs是肿瘤微环境中常见的亚细胞结构,参与生物活性物质的运输及细胞间信息交流。经特殊处理后,TMPs可与药物结合,参与药物在体内的运输和传递。基于此,本研究旨在探索TMPs作为生物来源的载体运送传统抗肿瘤药物多柔比星（DOX）在肝脏恶性肿瘤治疗中的安全性、疗效及相关机制。研究方法:（1）抗肿瘤药物选择:比较DOX、顺铂（CIS）、5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他滨（GEM）在体外条件下对多种肝脏恶性肿瘤细胞的杀伤作用。（2）肿瘤细胞来源的微颗粒包裹多柔比星（DOX-TMPs）的制备及相关表征检测:将肿瘤细胞暴露于紫外线（UVB）下照射1h,后放入含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24h,收集细胞上清液,通过差速离心的方法制备、纯化TMPs,后加入DOX共孵育,制备得到新鲜DOX-TMPs。TMPs及DOX-TMPs表征检测具体包括:通过纳米粒径分析仪（NTA）检测1×10~8个肿瘤细胞经UVB照射诱导后产生TMPs总数,对TMPs和DOX-TMPs的粒径进行检测。（3）TMPs安全性研究:首先,检测TMPs在体外条件下对多种肝脏恶性肿瘤细胞活性的影响;其次,通过腹腔注射的方式将TMPs注射至正常BALB/c小鼠腹腔内,观察小鼠是否形成恶性腹水或腹腔实体肿瘤;最后,通过腹腔注射的方式将TMPs注射至小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型腹腔中,观察TMPs是否加剧腹水形成,是否会对荷瘤小鼠生存期产生影响。（4）检测DOX-TMPs在体外条件下对多种肝脏恶性肿瘤细胞的杀伤作用。首先,将新鲜制备得到的TMPs用PKH-26荧光标记,然后将荧光标记的TMPs加入培养板与肿瘤细胞共培养,不同时间点（2h、4h、8h、24h）通过流式细胞仪检测肿瘤细胞对TMPs的摄取情况,并通过激光共聚焦显微镜观察TMPs在肿瘤细胞中的分布;其次,DOX-TMPs与H22（小鼠肝细胞癌细胞）、RBE（人源性肝内胆管癌细胞）、HepG2（人源性肝细胞癌细胞）或Huh-7（人源性肝细胞癌细胞）共培养后,多种方式检测DOX-TMPs对肿瘤细胞的杀伤作用。（5）DOX-TMPs在不同小鼠肝脏恶性肿瘤模型中的治疗效果及安全性研究:通过腹腔注射或皮下注射H22肿瘤细胞建立小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型或皮下瘤模型,自第五天起开始给予药物干预,每天一次,连续五天共五次,动态观察小鼠腹水体积或皮下瘤体积变化。构建小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型并行相关干预处理,记录各组小鼠生存时间,行生存分析。构建小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型并行相关干预处理,给药结束后通过眼球采血法取小鼠静脉血行肝、肾功能检查。（6）DOX-TMPs对肿瘤免疫微环境的影响:构建小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型并行相关干预处理,给药结束后取小鼠腹水行腹水细胞标记,主要包括恶性肿瘤细胞（CD45-）、T细胞各亚群（CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞）及巨噬细胞（CD11b+F4/80+）,后流式检测各细胞群绝对数目或比例并进行分析。研究结果:（1）通过NTA计数法,显示UVB照射诱导后1×10~8个肿瘤细胞大约可产生8×1010～1×1011个TMPs。TMPs的D10～D90为134.2±1.5nm～350.8±6.6nm,平均粒径约225.7±2.1 nm;DOX-TMPs的D10～D90为130±3.6nm～350.8±10.2nm,平均粒径约226.7±14.2nm。（2）纯化疗药物体外杀伤实验结果显示,与同浓度的CIS、GEM和5-FU相比,DOX对肿瘤细胞的杀伤作用更强。体外安全性实验结果显示,TMPs对肿瘤细胞活性未产生明显影响。DOX-TMPs体外杀伤实验结果显示,肿瘤细胞高效摄取DOX-TMPs后被有效杀伤。（3）TMPs在体内安全性实验结果显示,在正常BALB/c小鼠体内TMPs不具备致瘤作用;在小鼠肝脏恶性肿瘤腹水模型中TMPs不会促进腹水形成,不会对小鼠生存时间造成影响。动物模型实验结果显示,DOX-TMPs能有效抑制恶性腹水或皮下瘤生长,且不损伤小鼠肝、肾功能。生存分析表明,DOX-TMPs组小鼠生存时间明显延长。（4）经DOX-TMPs治疗后,小鼠腹水中肿瘤细胞数目明显减少。对小鼠腹水中免疫细胞分析后发现,与对照组相比,DOX-TMPs组小鼠腹水中CD3+T细胞,CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞比值升高,且差异存在统计学意义;与空白对照组相比,DOX-TMPs组小鼠腹水中CD11b+F4/80+细胞比值升高,且差异存在统计学意义。结论:DOX-TMPs是以TMPs为基础所建立的生物化疗平台。体外实验结果表明,DOX-TMPs对多种肝脏肿瘤细胞具备杀伤作用,能有效抑制肿瘤细胞生长。在BALB/c小鼠肝脏恶性肿瘤腹水和皮下瘤模型中,DOX-TMPs在不影响肝、肾功能的前提下,能明显抑制肿瘤生长,具有良好治疗效果。对小鼠腹水中肿瘤免疫微环境分析发现,经DOX-TMPs治疗后,小鼠腹水中淋巴细胞及巨噬细胞比值上调。TMPs作为生物来源的载体包裹并转运抗肿瘤药物DOX,不仅对肿瘤细胞产生直接化学杀伤作用,同时对肿瘤免疫微环境发挥一定的调节作用,增强药物杀伤效应,提高抗肿瘤治疗效果。