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【目的】建立CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞稳定的体外扩增体系,探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与单倍型相合造血干细胞移植GVHD的相关性以及对植入、GVHD、GVL、长期生存的影响;探讨HLA-Cw位点在单倍型相合造血干细胞移植中的作用,为优化供体的选择提供有价值的指标。【方法】在论文的第一部分,采用磁珠分选BalB/C小鼠脾脏中的CD4+T细胞,2ug/mlαCD3单克隆抗体包板,在含有1ug/mlαCD28单克隆抗体、rhIL-2 100U/ml和终浓度为10nM雷帕霉素RPMI-1640完全培养基中培养3周,流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞的表达,磁珠分选CD4+CD25+T细胞,实时定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达,单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验,IL-10和TGF-β1的测定,与未加雷帕霉素对照组进行比较,探讨雷帕霉素在体外对CD4+CD25+Foxp3+T细胞扩增的影响。论文的第二部分,按照成人给药剂量,给实验小鼠雷帕霉素灌胃3周后,流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞的含量,实时定量PCR检测脾细胞Foxp3 mRNA的表达,磁珠分选CD4+CD25+T细胞,进行体外抑制试验,ELISA检测小鼠血清中IL-10和TGF-β1的含量,与正常未给药组小鼠比较,了解雷帕霉素在小鼠体内对CD4+CD25+Foxp3+T细胞增殖的影响。在第三部分中,通过小鼠GVHD移植模型,观察发生GVHD时小鼠体内CD4+CD25+T细胞以及脾细胞内Foxp3 mRNA表达的变化,与正常未移植和自体移植小鼠对比,明确GVHD与CD4+CD25+Foxp3+T细胞之间的相关性。在论文的第四部分,通过尾静脉和腹腔注射两种途径,建立可移植性EL9611红白血病BalB/C和CB6F1小鼠模型,外周血涂片瑞氏-吉姆萨染色以及脏器的病理检查,了解接种EL9611红白血病小鼠脾细胞后,BalB/C和CB6F1小鼠发病规律。在第五部分中,通过对发病的CB6F1小鼠进行骨髓移植,观察输注雷帕霉素体外培养扩增的CD4+CD25+Foxp3+T细胞小鼠植入、GVHD、以及白血病复发,与自体移植组和GVHD组小鼠对比,明确CD4+CD25+Foxp3+T细胞对GVHD、植入和GVL方面的影响。在论文的最后部分中,采用高分辨的方法,对21例接受单倍型相合的造血干细胞移植的供受者的HLA-Cw位点进行检测,结合临床资料,分析供受者间HLA-Cw相容性对GVHD、白血病复发以及生存的影响。【结果】(一)在上述培养体系中,CD4+T细胞培养3周后,CD4+CD25+T细胞达(76.05±2.73)%,高于未加雷帕霉素组(52.17±1.36)%(P<0.001),Foxp3 mRNA的表达是对照组的5倍(P<0.001),增殖能力是对照组的0.29倍(P<0.001),对CD4+T细胞增殖抑制能力是对照组的3.6倍(P<0.001),培养上清中IL-10和TGF-β1分别是未加雷帕霉素组的1.8倍和1.6倍(P<0.001)。(二)雷帕霉素灌胃小鼠脾细胞CD4+CD25+T细胞是对照组的2.8倍(P<0.001),Foxp3 mRNA的表达是对照组的6倍(P<0.001),磁珠分选CD4+CD25+T细胞对CD4+T细胞增殖的抑制率与对照组相比无差异(57.03% vs 56.95%)(P>0.05)。雷帕霉素组和未给药组小鼠血清中IL-10的含量分别为(166.28±24.07)pg/ml和(79.50±7.68)pg/ml,TGF-β1的含量分别为(166.28±24.07)pg/ml和(88.52±10.06)pg/ml,各组间差异有显著性(P<0.001)。(三)在发生GVHD的时间点时,自体移植组和GVHD组小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为15.4%,GVHD组小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为24.03%,而正常未移植小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为8.46%,各组间差异有显著性(P<0.001);Foxp3 mRNA的表达在自体移植组和正常未移植组无差异(与HPRT标化后为0.1144 vs 0.1294)(P>0.05),而GVHD组小鼠Foxp3 mRNA的表达经标化后仅为0.0331(P<0.001)。(四)8～10周龄的BalB/C和CB6F1小鼠尾静脉注射1×106 EL9611红白血病小鼠脾细胞,外周血出现白血病细胞的时间分别为接种后的第6天和第7天,死亡时间分别为13.3天和21.7天。腹腔接种1×106 EL9611红白血病小鼠脾细胞,外周血出现白血病细胞的时间分别为接种后的第17.2天和第24.6天,死亡时间分别为21.7天和27.5天。(五)Treg移植组小鼠GVHD的累积发生率为28.6%,GVHD对照组累计发生率为100%,经Log Rank检验,P=0.000,自体移植组白血病复发率为57.14%,Treg移植组未发现白血病复发。在移植后第10天、20天和30天,Treg移植组小鼠测得的嵌合度均高于GVHD组小鼠。(六)在HLA-Cw位点相合组,II～IV度aGVHD的累积发生率为77%,而在HLA-Cw位点不相合组,II～IV度aGVHD的累积发生率只有14.3%,明显低于相合组,差异有显著性(P<0.01);HLA-Cw不合组28个月累积生存率为85.7%,相合组28个月累积生存率为49%,差异无显著性(P>0.05),可能与病例数较少有关。【结论】(一)雷帕霉素在体内和体外都能促进CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的增殖,而且增殖的CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞仍具有免疫调节作用。(二)发生GVHD时,CD4+CD25+T细胞增高,而CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的数量是降低的。(三)给CB6F1小鼠尾静脉注射1×106可移植性BalB/C小鼠EL9611红白血病脾细胞,可以建立稳定可靠的CB6F1小鼠白血病模型,但以尾静脉接种的EL9611红白血病小鼠适合于观察白血病小鼠的骨髓移植模型中GVL效应。(四)CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞不但能有效的减轻小鼠移植GVHD的发生,同时能促进植入,不削弱GVL效应。(五)在单倍型相合的造血干细胞移植中,供受者间HLA-Cw位点的检测可以作为优化供体选择的指标之一。