论文部分内容阅读
当代社会,随着医疗水平的飞速提升,人类已经可以有效的治愈多种疾病,但是仍然有各种各样的病症威胁着人们的生命,癌症就是其中重要的一类。因此,癌症的有效治疗药物一直都是医药化学界的研究热点。甾体化合物作为抗肿瘤药物之一,备受药物学家和有机化学家的关注,在药物研发中拥有巨大潜力。Cui课题组多年以来一直致力于甾体类化合物的合成与研究,发现了数种对体外癌细胞有良好抑制活性的甾体类化合物。其中,B-降胆甾苯并咪唑系列化合物不仅对肿瘤细胞有较好的抑制性,而且对HEK293T人体肾上皮细胞几乎没有细胞毒性,引起了我们的关注。然而,B-降胆甾苯并咪唑类化合物的作用靶点以及作用机制尚不明确。为了进一步探索该类化合物的机制与靶点,本文设计与合成了一系列具有生物素结构的B-降胆甾苯并咪唑化合物,基于生物学方法,筛选出合适的化合物结构,探索其作用机理,利用Western Blot方法验证作用通路。具体研究工作如下:（1）以胆固醇为母体,对A环3位进行修饰,延长A环3位侧链,再对B环进行结构改造,通过断开5位和6位碳间的双键打开胆甾B环,再通过三氧化二铝进行分子内缩合,得到3位具有不同侧链结构的B-降-3-氧基醇-5-羟基胆甾-6-醛结构;通过酯化在其3位延长出的碳链上连接生物素,测试体外抗肿瘤活性,对比不同侧链活性测试结果,筛选出合适的结构。（2）使用筛选出的B-降-3-氧基乙醇-5-羟基胆甾-6-醛为原料,在6位醛基上引入不同苯并咪唑结构,并通过酯化反应在3-氧基乙醇的羟基上连接生物素探针。通过上述反应,共制备得到了4种连接有生物素的胆甾杂环化合物。（3）用合成得到的4种连接有生物素探针的B降胆甾苯并咪唑化合物,分别作用于人宫颈癌细胞HeLa、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人胸腺癌细胞T47D、人乳腺癌细胞MCF-7以及人正常肾上皮细胞HEK293T,用MMT法筛选出对SK-OV-3细胞具有选择抑制性,同时对正常细胞几乎没有毒性作用的化合物7d。（4）用Annexin-FITC/PI双染法标记化合物7d作用48小时后的SK-OV-3细胞,用流式细胞仪检测出化合物7d作用后的SK-OV-3细胞增殖抑制方式属于细胞凋亡。再用PI单染法标记化合物7d作用48小时后的SK-OV-3细胞,用流式细胞仪检测出化合物7d作用后的SK-OV-3细胞增殖被阻滞于S周期。（5）用蛋白组学方法检测化合物7d在蛋白水平的作用,根据Western Blot检测显示,化合物7d在线粒体上通过下调Bcl-2蛋白相对水平,促使Bax蛋白上调,上调了caspase-9凋亡启动因子,促使下游caspase-3凋亡执行因子上调,进而诱导卵巢癌细胞SK-OV-3固有凋亡通路。（6）用UHPLC-QE-MS非靶标代谢组学的方法,分析了化合物7d作用后的SK-OV-3肿瘤细胞和没有给药的SK-OV-3肿瘤细胞代谢产物差异,找到了化合物7d导致代谢差异可能性最高作用通路:化合物7d在SK-OV-3肿瘤细胞体内,抑制了氨基酰tRNA的生物合成,从而抑制了氨基酸转运到核糖体合成蛋白质这一过程为。综上所述,本课题共合成了14种文献中未见报道的甾体化合物;通过IR、1H NMR、13C NMR和HREIMS等方法进行了结构表征;使用MTT法筛选出化合物7d;证明了其抑制肿瘤机理属于细胞凋亡,阻滞肿瘤细胞增殖于S期;用蛋白组学的方法,验证了化合物7d作用蛋白的通路和作用机理,为下一步靶点的探索提供了理论依据。