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骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes, MDS)是造血干细胞克隆性疾病,以骨髓一至多系无效造血为基本特征,具有发展为急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)的倾向。由于MDS的异质性,其诊断尚无“金标准”,是一个除外性诊断,部分非典型MDS的诊断及预后评估仍然十分困难。MDS多发于老年人,异基因造血干细胞移植(Allo-hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)由于在老年人的治疗相关死亡率高而不能作为治疗的常用方案,其他的对症支持治疗、免疫抑制治疗等虽可改善部分患者的症状,但无法改变疾病的自然进程。患者最终因血细胞减少导致的并发症或进展为AML而死亡。因此,探索MDS的发病机制,阐明MDS的发生发展进程,有助于我们开发出新的MDS治疗靶点,进而发展出更简便的诊断方法和更有效的治疗手段。MDS发病机制尚不明确。资料显示,细胞遗传学和分子缺陷以及基因突变与MDS的疾病进展及预后密切相关,不少MDS患者可发现有染色体异常和关键基因的突变。通过克隆分析技术研究发现,MDS是起源于造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的克隆性疾病,其在多个步骤上积累了遗传和表观遗传学的改变而演变成为白血病。因此在MDS发病的源头上对其进行研究并探索其特异性分子遗传学改变是认识与战胜MDS的关键,也一直是该领域的研究热点。视网膜母细胞瘤蛋白相互影响的锌指基因1(Retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene 1, RIZ1)是近年来发现的一种抑癌基因,在多种实体瘤中均表达下降或无表达。其机制可能与RIZ1基因启动子CpG岛的异常甲基化有关。同样在血液系统肿瘤中也发现RIZ1表达被抑制。然而RIZ1在MDS患者骨髓细胞中的表达尚无报道。近年来,对MDS干细胞克隆研究主要集中在CD34+CD38-等原始造血干细胞群中。利用CD34+CD38-表型,已成功地获得了各型白血病干细胞,并延伸出了肿瘤干细胞理论和实践的全新发展,但MDS CD34+CD38-细胞具有相当的异质性,因此研究尚少。本课题初步研究了RIZ1在MDS患者骨髓细胞中的表达及其与危险程度分级的关系,并对各类MDS骨髓中CD34+CD38-细胞群进行多种分子或生物标志的共表达研究,旨在寻找更多更特异性的表面标记,为阐明MDS的发生发展机制提供新的实验基础和理论知识,为MDS的早期诊断和靶向治疗提供可能的新方向和靶标。第一部分RIZ1在骨髓增生异常综合征患者骨髓中的表达研究目的：研究抑癌基因RIZ1在MDS患者和正常人以及不同亚型和不同危险度分组患者骨髓细胞中的表达情况,并比较其差异。方法：以初发未治疗的MDS患者22例为研究对象,非恶性血液系统疾病患者6例为正常对照。收集其骨髓中的单个核细胞,采用实时定量RT-PCR技术检测RIZ1表达情况。然后依据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)标准,先将MDS患者分为5个亚型分组：难治性贫血(refractory anemia, RA),8例；难治性血细胞减少伴多系病态(refractory cytopenia with multilineage dysplasia, RCMD),2例;原始细胞过多性难治性贫血-1型(refractory anemia with excess blasts-1, RAEB-1),6例：原始细胞过多性难治性贫血-2型(refractory anemia with excess blasts-2, RAEB-2),5例和5q-综合征(MDS associated with isolated del(5q),5q-),1例。再将其分为2个危险度分组：低危组(包括RA, RCMD and 5q-)和高危组(包括RAEB-1和RAEB-2)。分析各组RIZ1表达情况,并比较各组间差异。RIZ1表达量采用相对定量,以均值±标准差(x±s)表示。结果：MDS组患者的RIZ1表达量为0.59±0.27,对照组患者的RIZ1表达量为1.00±0.19,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。排除了一例同时患有前列腺癌的患者后,与对照组相比,21例MDS患者中的15例即71%的MDS患者有RIZ1表达显著下降(P<0.05)。RCMD (0.29±0.05), RAEB-1 (0.64±0.15)和RAEB-2 (0.31±0.09)各亚型分组中的RIZ1表达较对照组显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。而RA组(0.84±0.36)与对照组之间的RIZ1表达差异无统计学意义。高危组RIZ1表达(0.49±0.18)较对照组显著下降(P<0.05),而低危组RIZ1表达(0.70±0.35)较对照组无统计学差别。结论：RIZ1的表达明显下调在MDS中是一个常见现象,其可能与MDS的发病有关。RIZ1的表达水平在MDS不同亚型和不同危险度分组之间存在差异,可能预示着其与MDS危险程度分级的相关性以及疾病进展过程中的重要作用。第二部分骨髓增生异常综合征患者造血干细胞表面标记分子的表达研究目的：探索MDS患者骨髓中CD34+CD38-细胞多种表面标记分子的共表达情况及其在不同亚型和不同危险度分组之间的表达差异,并与正常干细胞进行对比,以寻找MDS干细胞特异性标记分子,阐明MDS干细胞表面异常抗原表达与疾病进展及预后的关系。方法：以初发未治疗的MDS患者38例为研究对象,非恶性血液系统疾病患者10例为正常对照。收集其骨髓中的单个核细胞,采用多色荧光流式细胞术测定CD34+CD38-细胞群一系列膜表面抗原分子的表达。然后依据WHO标准,先将MDS患者分为5个亚型分组：RA,11例；RCMD(包括环形铁粒幼细胞性难治性血细胞减少伴多系病态, RCMD and ringed sideroblasts, RCMD-RS),9例；RAEB-1,7例；RAEB-2,10例和5q-,1例。再根据国际预后评分系统(International Prognostic Scoring System, IPSS)将其分为4个危险度分组：低危组(low-risk, LOW-R),6例；中危组-1(intermediate-1-risk, INT-1-R),20例；中危组-2 (intermediate-2-risk, INT-2-R),8例；高危组(high-risk, HIGH-R),4例。分析各组间CD34+CD38-细胞群一系列膜表面抗原分子的表达差异。结果：对照组和MDS组中,所有患者的CD34+CD38-细胞共表达CD13, CD33, CD117, CD133和HLA-DR,两组间CD33、CD117和HLA-DR表达水平无差异,MDS组CD13、CD133表达水平高于对照组,分别是79±16% vs 36±13%(P<0.05)和66±20% vs 25±13%(P<0.05)。CD90在对照组所有患者的CD34+CD38-细胞均有表达,而MDS组只有63%的患者表达,且两组间表达量有显著差异(32±19% vs 12±3%, P <0.05)。CD2, CD5, CD7, CD44, CD96和CD123在对照组无一例表达,而在17～53%的MDS患者有一定量的表达,其表达量分别是：CD2 (47±22%), CD5 (44±28%), CD7 (20±9%), CD44 (35±15%), CD96 (43±19%)和CD123 (54±23%)。CD19在两组患者干细胞中均无表达。髓系标志CD13、CD33和干祖细胞标志CD117、CD133、HLA-DR在各个亚型的MDS患者CD34+CD38-细胞上均有表达,其中,RCMD (89±7%)、RAEB-1(88±11%)和RAEB-2(81±13%)各亚型组的CD13阳性细胞百分比显著高于RA组(63±16%,P<0.05)。淋系标志CD2. CD5和CD7多出现在RCMD, RAEB-1和RAEB-2组,而不是RA和5q-组,但其阳性细胞百分比较低。CD90阳性患者比例从RA组到RAEB-2组呈逐渐降低趋势,而CD96和CD123则呈逐渐升高趋势,但趋势无统计学意义。CD90阳性患者比例从低危组到高危组呈逐渐降低趋势,而CD2、CD5、CD7、CD96和CD123则呈逐渐升高趋势,但趋势也无统计学意义。结论：MDS干细胞具有复杂的免疫表型,与正常干细胞及白血病干细胞既有相似又有不同,因此仅仅依靠干细胞表面抗原为靶标寻找治疗手段相当困难。高危亚型MDS患者干细胞的CD13阳性细胞百分比显著增高,其可能成为判断MDS患者预后的潜在指标。