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研究目的:Na-K-ATP酶作为已被熟知的膜蛋白,广泛参与了人体生理及病理各个过程。在正常生理情况下,它参与了膜内外离子平衡的调节,维持静息电位,以及细胞膜内外的物质代谢等。而病理情况下,如偏头痛、家族性癫痫、充血性心力衰竭等,Na-K-ATP酶也发挥着相应的作用。也有相应的研究表明,Na-K-ATP酶对肿瘤的发生发展也起着重要的作用。在肿瘤细胞中,除了经典的对膜内外离子浓度的影响外,Na-K-ATP酶被证实能够在与其配体强心苷类药物(cardiac glycosides,CGs)结合的情况下,激活Src激酶,引发下游Raf/MAPK通路的激活,从而增加了活性氧(ROS)的合成。以及,它能够通过抑制Akt及NF-κB的激活等一系列途径来抑制肿瘤。Na-K-ATP酶拥有α、β及FXYD这3种亚基,每种亚基也存在不同亚型。而不同亚型的作用也不尽相同。作为Na-K-ATP酶功能的主要“执行者”,α亚基拥有4种亚型,其中因α1亚基(ATP1A1)广泛存在于各个组织细胞膜上而被研究较多,它被认为在某些肿瘤中高度表达,并促进肿瘤的发生发展。而对其他亚基则关注较少,其中,α2亚基(ATP1A2)更是知之甚少。本研究主要关注于ATP1A2对乳腺癌的影响,以及相关机制的研究。实验方法:1.对癌症及肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中数据进行下载,使用GraphPad Prism 5.0及SPSS 19.0进行ATP1A2的表达量、生存及表达与临床相关性分析。2.对14对乳腺癌及癌旁组织提取mRNA,通过定量PCR(RT-qPCR)检测其中ATP1A2 mRNA表达的差异。对17对乳腺癌和癌旁组织进行免疫组化染色,检测其ATP1A2蛋白的表达。3.在低表达ATP1A2的乳腺癌细胞系MDA-MB-231及SK-BR-3细胞中转染ATP1A2和空载质粒,加入G418进行筛选,14天后通过半定量PCR及Western blot挑选出稳定过表达ATP1A2的细胞株。对稳定株进行CCK-8、transwell以及流式细胞实验检测,对过表达组与对照组的增殖、侵袭、凋亡和周期阻滞情况进行比较。4.通过Western blot,检测Src、PI3K、Akt等相关蛋白在过表达组和对照组中的表达情况。实验结果:1.通过对TCGA数据库数据的分析发现,在Na-K-ATP酶的4种亚基中,只有ATP1A2在肿瘤中表达下调,差异具有统计学意义(p<0.05),而且其表达水平和生存分析、肿瘤大小,以及ER、PR、HER-2的表达情况都有相关性(p<0.05)。2.RT-qPCR和免疫组化的结果表明,不管是转录水平还是翻译水平上,ATP1A2在乳腺癌中的表达均低于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.通过CCK-8、克隆形成实验、transwell以及流式细胞实验发现,相比于对照组而言,过表达组的增殖、侵袭被抑制,而凋亡增加,并发现在G0/G1期存在周期阻滞。以上结果均具有统计学意义(p<0.05)。4.通过Western blot实验发现,与对照组相比,过表达组的Src、PI3K、Akt、NF-κB的磷酸化,Bcl-2、Bcl-xl的表达被抑制,而Bax、P21上调。实验结论:1.在TCGA数据分析中发现,ATP1A2在乳腺癌中下调,并且这种下调与临床特征具有相关性,表明其表达水平可能与乳腺癌的预后相关。而高表达组无论是在生存分析,还是在临床特征的相关性分析中,都提示了低表达组具有更优预后的可能。说明ATP1A2在乳腺癌中可能起着抑癌的作用。2.通过对人体乳腺癌和癌旁组织样本免疫组化和对组织mRNA表达的分析,验证了对TCGA数据库数据分析中得出的关于ATP1A2在乳腺癌中低表达的结论。3.在稳定过表达ATP1A2后进行的相关功能实验中得出过表达ATP1A2能够抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭,增加凋亡和引起细胞周期阻滞,这些结果进一步证实了ATP1A2能够抑制乳腺癌。4.而通过Western blot可以证实,过表达ATP1A2后能够抑制Src/PI3K/Akt信号通路,而该通路的激活能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等行为。综上所述,ATP1A2在人乳腺癌中下调,并与乳腺癌预后相关。能抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭,引起凋亡和细胞周期阻滞,而这些抑癌作用是通过抑制Src/PI3K/Akt信号通路来实现的。这或许能够对治疗乳腺癌带来新思路和新视角。