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近年来,随着我国食品行业的飞速发展,食品的数量和种类都得到了突飞猛进的增长,但病原菌引起的食物中毒事件接连发生,当前我国常规微生物检测方法检测耗时长,步骤繁琐、灵敏度低,难以满足检测的需求。在致病菌中其中蜡样芽孢杆菌生长条件宽松,生存范围广,极易污染食物,特别是肉、蛋、奶和它们制成的食品,被人误食后极易引起食物中毒,是人类的一种重要的食源性病原菌。当前,对蜡样芽孢杆菌的检测,我国通常使用传统的国标法,此方法虽然检测结果可靠,但是该试验法在操作步骤繁多,检测出结果的时间长,而新型的快速检测方法,如免疫学方法,聚合酶链式反应,生物传感器技术等等都或多或少存在检测成本高,结果不可靠,或者是对操作人员专业素质要求高等等因素,导致了这些方法不能打规模推广使用。Notomi T.等人在2000年研发出了环介导等温扩增技术(LAMP),在恒温条件下的高效扩增反应,几十分钟即可完成,其扩增产物既可通过电泳检测,也可以通过加入染料SYBY GreenⅠ后再用肉眼判定结果和焦磷酸镁浊度检测。实时荧光环介导等温扩增反应是在LAMP的基础上发展的一种新的检测技术。基于LAMP反应上的优点,改进了LAMP的缺陷。本研究是根据LAMP的反应原理,在反应体系添加荧光染料,通过反应产物与荧光染料结合发出荧光的特点,利用实时荧光监测仪(ESE-Quant Tube Scanner)进行实时的监控,建立实时荧光环介导等温扩增技术(Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplication,简称Real Amp)检测蜡样芽孢杆菌的方法。本研究基于蜡样芽孢杆菌的hbl A基因序列,利用在线引物设计软件Primer V4设计四条特异性引物。通过体系优化包括Mg2+的添加量、d NTPs的浓度、Bst DNA聚合酶、引物的添加量及内外引物的比例等,扩增条件优化优化了反应温度,利用实时检测仪监测反应进程并给出监测结果。最终优化的反应体系:外引物F3与B3各0.5μL,内引物BIP与FIP 2.5μL,Mg SO4终浓度1.0 m M,0.3m M d NTPs,10×Theromo Pol Reaction Buffer 2.5μL,Bst DNA聚合酶(8000U)l.5μL,DNA模板2μL,甜菜碱0.5μL,荧光染料0.5μL,dd H2O补足体积到25μL。扩增反应条件:63℃反应80min。通过21株致病菌验证Real Amp特异性,结果表明4株蜡样芽孢杆菌结果显示阳性,而其他17株非蜡样芽孢杆菌结果显示均为阴性,说明该试验方法特异性高。并比较了Real Amp与普通LAMP的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定,结果表明,该方法对蜡样芽孢杆菌的敏感度达8.2CFU/m L,比普通LAMP高十倍,Real Amp实际样品的检出限为8.2CFU/m L。结果表明,对蜡样芽孢杆菌检测的方法中,Real Amp检测的方法快速,简单,灵敏度高和特异性强,成本低廉等优点。此方法可以被广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。