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目的：建立胆管癌Smad4KD稳定细胞系并对其进行鉴定。方法：采用用胆管癌细胞系HuCCTl和RBE作为研究对象,采用western blotting检测Smad蛋白的表达,并用外源性TGF-β刺激胆管癌细胞后检测Smad蛋白的磷酸化水平。从国外购买已被文献验证的有效pRetroSuper-puro Smad4质粒及其空载体。将质粒转染PT67细胞以包被逆转录病毒颗粒。收集病毒上清,分别感染野生型胆管癌细胞系,建立Smad4干扰组以及相应的空载体对照组。使用嘌呤霉素筛选获得表达耐药基因阳性的细胞系。以western blotting和Co-immunoprecipitation检测上述细胞系中Smad4蛋白的表达情况及Smad2/3/4复合物的形成情况。结果：HuCCT1和RBE细胞均表达TGF-βI型受体、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白,而且外源性TGF-p时间依赖性地诱导Smad2和Smad3磷酸化。野生型和空载体对照组胆管癌细胞均表达Smad4,干扰组胆管癌细胞的Smad4表达量显著下降(P<0.01)。经外源性TGF-β刺激后,干扰组胆管癌细胞无法形成正常量的Smad2/3/4复合物。结论：已成功建立稳定干扰Smad4表达的胆管癌细胞系。目的：探讨Smad4对胆管癌细胞生长的作用。方法：将TGF-p和或TGF-p受体I抑制剂SB431542处理野生型HuCCT1细胞,分别于处理后的0d、1d、2d、3d、4d、5d和6d通过CCK-8试剂盒检测胆管癌细胞的增值情况。将TGF-p处理野生型RBE细胞,分别于处理后的Oh、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h通过CCK-8试剂盒检测胆管癌细胞的增值情况。在进行Smad4干扰后,将外源性TGF-p处理野生型、空载体对照组和干扰组细胞5d(HuCCT1)或48h (RBE),再通过CCK-8试剂盒检测各组胆管癌细胞的增值情况。采用western blotting检测各组HuCCT1细胞的cyclinA2和p21蛋白的表达水平,以及RBE细胞的phospho-Rb和p21蛋白的表达水平。分别将野生型、空载体对照组和干扰组HuCCT1细胞注射入裸鼠皮下,观察各组裸鼠的皮下成瘤情况。结果：TGF-β均能抑制HuCCTl和RBE细胞增殖。与野生型和空载体对照组细胞相反,干扰组RBE细胞对TGF-β抑制增殖的效应不敏感；TGF-β对干扰组HuCCT1细胞的增殖仅有轻度抑制作用,而且干扰组HuCCT1细胞在没有TGF-β作用下的生长速度快于野生型和空载体对照组细胞。无论是有或无TGF-β作用,干扰组HuCCT1细胞的cyclin A2蛋白的表达水平均高于野生型和空载体对照组细胞,TGF-β诱导干扰组HuCCT1细胞表达p21蛋白的水平明显低于空载体对照组；在TGF-β作用下,干扰组RBE细胞的Rb蛋白磷酸化水平高于野生型和空载体对照组,而p21表达量明显低于野生型和空载体对照组。与野生型和空载体对照组HuCCT1细胞所形成皮下瘤相比,干扰Smad4的HuCCT1细胞在裸鼠皮下形成的肿瘤体积更大。结论：Smad4介导胆管癌细胞的生长抑制,其机制可能是通过降低cyclin A2的表达和Rb蛋白的磷酸化水平,以及介导p21表达。目的：探讨Smad4对胆管癌细胞凋亡的作用。方法：将不同浓度的TGF-β处理野生型RBE细胞36h,以及将1ng/ml的TGF-β分别处理野生型RBE细胞0、12、24、36和48h,细胞经PI/Annexin-Ⅴ染色后进行流式细胞分析,检测细胞凋亡,并且通过western blotting检测不同时间点Bim和Bcl-2蛋白的表达以及caspase和PARP蛋白的激活情况；再将泛caspase抑制剂与TGF-β联合作用于野生型RBE细胞36h后,通过流式细胞术检测细胞凋亡。将1ng/ml的TGF-β分别处理空载体对照组和干扰Smad4组RBE细胞36h,采用同样的方法检测细胞凋亡。将TGF-β和/或JNK抑制剂SP600125作用于野生型RBE细胞36h后,通过流式细胞术分析比较各处理组细胞的凋亡,通过western blotting检测Bim和Bcl-2蛋白的表达以及caspase和PARP蛋白的激活情况；将泛caspase抑制剂与TGF-β和/或SP600125联合作用于野生型RBE细胞36h后,通过流式细胞术检测细胞凋亡。将TGF-β和/或SP600125分别作用于空载体对照组和干扰Smad4组RBE细胞36h,然后通过流式细胞术分析比较此两组细胞的凋亡,通过western blotting检测Bim和Bcl-2蛋白的表达以及caspase和PARP蛋白的激活情况。将TGF-β和/或SP600125作用于野生型RBE细胞6h后,通过western blotting检测Smad2和Smad3的磷酸化水平。将带有荧光素酶报告基因的质粒转入野生型RBE细胞,然后将TGF-β和/或SP600125处理细胞24h,最后分析TGF-β诱导报告基因的转录活性。将带有荧光素酶报告基因的质粒转入空载体对照组和干扰Smad4组RBE细胞,然后将TGF-β和/或SP600125分别作用于两组细胞24h,最后分析TGF-β诱导报告基因的转录活性。结果：TGF-β剂量依赖性地和时间依赖性地诱导野生型RBE细胞发生凋亡。与空载体对照组相比,shSmad4RBE细胞对TGF-β的促凋亡效应不敏感。SP600125增强TGF-β诱导野生型RBE细胞凋亡的效应。与空载体对照组相比,shSmad4RBE细胞对SP600125的促凋亡效应不敏感。接受泛caspase抑制剂处理的野生型RBE细胞对TGF-β和SP600125的促凋亡效应不敏感。TGF-β时间依赖性地诱导Bim表达上调、Bcl-2表达下调、以及caspase和PARP蛋白激活。SP600125增强TGF-β诱导的Bim表达上调、Bcl-2表达下调、以及caspase和PARP蛋白激活,该效应在干扰Smad4表达后被阻断。SP600125增强TGF-β诱导的Smad2和Smad3的磷酸化水平以及荧光素酶报告基因的转录水平。干扰Smad4表达能阻断SP600125对TGF-β诱导荧光素酶报告基因转录的增强效应。结论：Smad4介导TGF-p对RBE细胞的促凋亡效应,SP600125依赖Smad4介导增强TGF-β对RBE细胞的促凋亡效应,线粒体相关的caspase蛋白活化参与Smad4对凋亡的调控。目的：探讨Smad4在胆管癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、迁移和侵袭中的作用。方法：将TGF-β1分别作用于野生型RBE细胞0、6、12、24和48h,通过western blotting检测不同时间点N-cadherin和E-cadherin蛋白的表达。并于TGF-β1处理24h后在显微镜下观察野生型RBE细胞的形态。将TGF-β1分别作用于空载体对照组和干扰Smad4组RBE细胞24h,在显微镜下观察两组细胞的形态,通过western blotting检测两组细胞N-cadherin和E-cadherin蛋白的表达。对野生型HuCCT1细胞划痕,经TGF-β1和／或TGF-β受体I抑制剂SB431542处理24h后在显微镜下拍照。将TGF-β1和／或SB431542分别处理野生型HuCCT148h和72h后,通过western blotting检测N-cadherin、MMP-9和Vimentin的表达。对空载体对照组和干扰Smad4组HuCCT1细胞划痕,经TGF-β1和／或SB431542处理24h后在显微镜下拍照。将空载体对照组和干扰Smad4组HuCCT1细胞加入transwell小室内,用TGF-β1和／或SB431542处理细胞24h,经过固定和结晶紫染色后在显微镜下计数并拍照。将空载体对照组和干扰Smad4组HuCCT1细胞加入事先包被Matrigel的transwell小室内,用TGF-β1和/或SB431542处理细胞48h,经过固定和结晶紫染色后在显微镜下计数并拍照。用TGF-β1/或SB431542处理空载体对照组和干扰Smad4组HuCCT1细胞48h和72h,通过western blotting检测N-cadherin、MMP-9和Vimentin的表达。将野生型、空载体对照组和shSmad4组HuCCT1细胞分别注射入裸鼠腹腔,于8周后观察肿瘤细胞播散至膈肌并形成癌灶的情况。结果：TGF-β1诱导RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变,促进N-cadherin表达增加和E-cadherin表达降低。在无TGF-β1处理时,Smad4干扰组细胞比空载体组细胞的形态更趋于上皮样,E-cadherin表达水平也高于空载体组。在TGF-β1处理24h后,Smad4干扰组细胞形态的间质样变化程度、N-cadherin表达量明显低于空载体组;空载体组细胞E-cadherin的表达缺失,而Smad4干扰组细胞仍表达E-cadherin。在划痕实验中,TGF-β1促进野生型HuCCT1细胞迁移；在有／或无TGF-β1刺激下,shSmad4HuCCT1细胞的迁移能力均弱于空载体对照组细胞。在transwell实验中,TGF-β1诱导shSmad4HuCCT1细胞直接穿出transwell小室底膜的细胞数明显少于空载体对照组细胞；无论有无TGF-β1作用,shSmad4HuCCTl细胞通过Matrigel穿出transwell小室底膜的细胞数均明显少于空载体对照组细胞。TGF-β1诱导野生型HuCCT1表达N-cadherin、MMP-9蛋白并增强Vimentin蛋白的表达；无论有无TGF-β1作用,shSmad4HuCCT1细胞N-cadherin、MMP-9和Vimentin的表达水平均明显低于空载体对照组细胞。与野生型和空载体对照组细胞相比,shSmad4HuCCTl细胞从裸鼠腹腔播散至膈肌并形成癌灶的能力明显减弱。结论：Smad4介导RBE细胞发生上皮-间质转化；Smad4可能通过促进N-cadherin、MMP-9和Vimentin表达上调以介导HuCCT1细胞发生迁移和侵袭。