2，3-丁二醇（简称2，3-BD）是一种重要的化工原料和潜在的平台化合物，具有广阔的应用前景;其分子内含有两个手性碳原子，存在三种立体异构体，分别是(R，R)-2，3-丁二醇(左旋型，简称(R，R)-2，3-BD）、(S, S)-2，3-丁二醇(右旋型，简称(S, S)-2，3-BD）和meso-2，3-丁二醇（内消旋型，简称meso-2，3-BD）。光学纯的(R，R）-2，3-BD不仅具有混旋型2，3-BD的功能用途，还因其特定的手性基团和空间构型而具备独特应用，拥有比混旋型2，3-BD更高的附加价值。针对(R，R)-2，3-BD的生产，传统的化学合成法工艺复杂、实现困难，天然微生物发酵的方法又难以获得高纯度的目标产物，致使科研工作者们将目光转移至可实现非天然代谢产物合成的代谢工程和合成生物学领域。借助于立体特异性的(R，R)-2，3-丁二醇脱氢酶，较高对映体纯度的(R，R)-2，3-BD可由基因工程菌发酵获得，但是以往研究中目标产物的产量及产率有限，使其难以有进一步的发展利用空间。本文在全面分析(R,R)-2，3-BD生物制造进展的基础上，将研究重点定位于实现光学纯(R，R)-2，3-BD的高效积累，从重组菌株构建、发酵过程优化和分析检测等三方面展开研究，为实现高效率的(R, R)-2，3-BD生物制造过程奠定基础。　　本研究主要内容包括：⑴采用重叠延伸PCR的手段构建了多基因共表达质粒(含α-乙酰乳酸合成酶编码基因budB，α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因budA和(R,R)-2，3-丁二醇脱氢酶编码基因ydjL），通过重组质粒电转化大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655的方式成功获得重组菌E.coli MQ1，并使(R，R)-2，3-BD代谢途径的相关基因在重组菌内稳定存在。经过1 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（简称IPTG）的诱导，重组菌MQ1表现出较高的外源蛋白表达量，具备合成目标产物的潜力。⑵建立了针对α-乙酰乳酸合成酶（简称ALS）、α-乙酰乳酸脱羧酶(简称ALDC)和2，3-丁二醇脱氢酶（简称2，3-BDH）的酶活检测方法，并对重组菌和原始菌体内外源蛋白的酶活力进行分析。结果表明，原始菌E.coli MG1655几乎未表现出三种关键酶的活性;添加1 mM IPTG诱导的重组菌E.coli MQ1显示出比不添加IPTG条件下更高的三种关键酶的活性，表明IPTG的添加确实能诱导相关代谢途径的表达。⑶在相同条件下，对原始菌和重组菌进行摇瓶发酵性能比较，重组菌以1 mMIPTG诱导其外源蛋白表达。摇瓶发酵结果表明，原始菌E.coli MG1655在菌体生长和葡萄糖消耗方面存在障碍，菌体获得的最高OD600为5.69，全过程耗糖约6 g/L，发酵主产物为乙酸(5.05 g/L);重组菌E.coli MQ1菌体生长良好，葡萄糖消耗能力有所提升，菌体获得最高OD600为15.24，全过程耗糖约29 g/L，发酵主产物为(R, R)-2，3-BD(6.50 g/L)。该结果表明，外源(R，R)-2，3-BD代谢途径的引入对E.coli MG1655菌体的生长代谢具有一定的促进作用，推测该代谢途径的引入使菌体胞内的代谢流分布发生改变，使得原先主要流向乙酸的代谢流部分转向了2，3-丁二醇，一定程度上缓解了乙酸对菌体的抑制作用。⑷研究了诱导剂IPTG的浓度对重组菌发酵的影响。结果表明，不添加1PTG的条件更有利于重组菌E.coli MQ1发酵产(R, R)-2，3-BD，该条件下，菌体生长良好，能迅速消耗葡萄糖并大量积累目标产物，推测该条件下的蛋白表达量及关键酶的活性已能够满足(R，R)-2，3-BD代谢途径高效运作的需要，足以引起宿主菌胞内代谢流的重新分配;然而一旦添加IPTG，菌体消耗葡萄糖及合成目标产物的能力均受到严重影响，推测原因主要是IPTG引起的蛋白过表达导致了“蛋白质负担”这一负面作用。最终，在不添加IPTG的条件下，重组菌E.coli MQ1摇瓶批次发酵获得(R, R)-2，3-BD的最高产量为33.83 g/L，对映体纯度＞99％，目标产物对底物葡萄糖的得率为0.45 g/g，生产强度为1.25 g/(L·h)。⑸在3L发酵罐上考察了不同通气条件对重组菌E.coli MQ1（不添加IPTG）发酵的影响。结果表明，溶氧较充足的条件(1.5 vvm，400 rpm)更利于(R，R)-2，3-BD的积累，在该条件下，主要副产物乳酸的浓度大幅降低，菌体生长和底物消耗均表现良好。最终，重组菌E.coli MQ1批次发酵获得(R, R)-2，3-BD的最高产量为33.72 g/L，对映体纯度＞99％，目标产物对葡萄糖的得率为0.40 g/g，生产强度为2.11 g/(L·h)。