研究背景糖尿病发病率正逐年上升,而血管并发症已成为其致残致死的主要原因。血管内皮细胞凋亡是血管功能失调乃至血管病变的始动原因。糖尿病患者的多种代谢紊乱,是造成血管内皮微环境失衡、诱发内皮细胞功能障碍,甚至凋亡的危险因素。血管内皮细胞的凋亡不但削弱了血管的抗炎等多种防御功能,而且破坏抗凝纤溶系统平衡,诱导血栓形成,促使粥样斑块形成,由此可引起糖尿病一系列血管并发症,如动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS),故抑制血管内皮细胞凋亡、保护血管内皮对于遏制糖尿病性血管病的发生发展具有积极意义。糖基化终产物(Advanced glycation end products, AGEs)是体内可还原糖的醛基与蛋白质的氨基发生非酶糖基化反应的终末期产物。AGEs沉积于血管壁,从而诱导内皮细胞凋亡,是导致糖尿病并发血管病变的关键因素之一。AGEs随着年龄增长而累积增加,而在糖尿病的高糖状态下,其形成加速。糖尿病患者的血清、多种组织中AGEs水平显著高于正常人群,而且AGEs水平和糖尿病血管并发症的严重程度存在相关性。AGEs在糖尿病血管并发症的发生、发展中起着十分重要的作用。目前认为,AGEs激活氧化应激是造成内皮细胞受损的关键环节。长期高血糖状态下所形成的大量AGEs在血管壁尤其是AS高发位点沉积,由AGEs受体(receptor of AGEs,RAGE)介导激活氧化应激,诱发活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)生成增多,活化核转录因子(NF-κB),炎症因子,增加内皮细胞的促凝活性,诱导血管内皮细胞损伤、凋亡。体内大量AGEs形成后难以通过自身代谢或药物而被清除,故如何保护AGEs诱发的糖尿病性血管损伤,已逐渐成为众多学者关注的问题。近年有研究显示,胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)可通过下调RAGE的表达而抑制AGEs-RAGE轴对内皮细胞的氧化损伤。GLP-1还能拮抗AGEs诱导的胰岛细胞氧化还原失衡、胰岛素分泌受抑制等负面效应。GLP-1是主要由肠道内分泌L细胞分泌的多肽,作为一种安全、有效的促胰岛素分泌剂越来越受到关注,是治疗2型糖尿病(Type2Diabetes Mellitus,T2DM)的一种新途径。GLP-1除了广为人知的促进胰岛p细胞增殖、抑制p细胞凋亡、促进胰岛素分泌等作用外,近年来的研究显示其在糖尿病血管病变中亦起着重要作用。GLP-1可降低TNF-a诱导的炎症分子水平,以减少高凝状态和炎症反应对内皮细胞的损伤,故有学者建议将GLP-1长效类似物利拉鲁肽(liraglutide)用于T2DM合并AS的早期治疗。GLP-1可抑制单核细胞粘附于人主动脉内皮细胞,减轻血管炎性损伤,阻止AS的进展。此外,GLP-1受体激动剂exendin-4激活PKA-PI3K/Akt-eNOS信号传导通路而刺激内皮细胞增殖,以促进血管损伤后的迅速修复。GLP-1保护内皮细胞可能与抑制氧化应激有关,但其机制目前尚不完全清楚。有研究显示,GLP-1呈剂量依赖性降低AGEs诱导下人血管内皮细胞的ROS水平。GLP-1还可通过上调抗氧化基因的表达而抑制过氧化氢(H202)诱导的内皮细胞氧化损伤。在用高同型半胱氨酸(High homocysteine,HHcy)建立氧化损伤的模型中,exendin-4通过抑制氧化应激而升高血管保护因子NO水平。除抗氧化作用之外,PI3K/Akt及其下游的分子信号可能也参与了GLP-1保护血管内皮细胞的作用。有研究发现,exendin-4激活PKA, PI3K/Akt信号转导通路而促人主动脉内皮细胞增殖。PI3K/Akt信号通路的活化可作用于其底物促凋亡蛋白Bad,进而影响线粒体的凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值。Bcl-2/Bax比值降低,线粒体通透性增加,细胞色素c(cytochrome c,cyto-c)释放入胞浆,继续激活下游的caspase-9,后者再促进caspase-3水解,最终导致内皮细胞凋亡Zhou YJ等发现AGEs通过上调Bax水平而降低Bcl-2/Bax比值,促进内皮细胞凋亡。在胰岛β细胞、心肌细胞、胆囊细胞,GLP-1可通过调节Bcl-2家族相关蛋白活性和／或caspase活性而抑制细胞凋亡。那么在内皮细胞,GLP-1对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响是否也和caspase、Bcl-2家族,以及cyto-c有关呢?探求GLP-1在胰岛之外的血管作用及机制,挖掘潜在的分子靶标,对T2DM尤其合并血管病变的T2DM患者来说具有积极意义。本研究以AGE修饰的牛血清白蛋白(AGE-modified BSA,AGE-BSA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡为研究模型,探讨GLP-1干预对内皮细胞凋亡的影响及其相关机制,探求抗氧化损伤在糖尿病血管病变防治中的重要性,以期为拓展GLP-1的临床价值提供实验基础。目的本课题拟在建立AGEs诱导HUVECs凋亡为研究模型的基础上,通过观测GLP-1干预对AGEs诱导内皮细胞凋亡的作用,并检测其对凋亡相关分子及P13K/Akt通路的影响,初步探讨GLP-1对AGEs诱导细胞凋亡的影响及分子机制。内容课题分以下两大部分：第一部分胰高血糖素样肽-1对糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡的影响目的建立AGEs诱导HUVECs凋亡的研究模型,观测GLP-1干预对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响。方法1.体外制备、鉴定糖基化终产物将牛血清白蛋白(BSA)和D-葡萄糖溶于PBS,避光孵育12周制备AGE-BSA。以荧光分光光度计鉴定AGE-BSA。2.分离、培养、鉴定HUVECs取新生儿脐带,注入I型胶原酶消化,收集内皮细胞悬液,用M199培养液培养,置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养。细胞经vWF抗体免疫荧光染色进行鉴定。3.四唑盐(MTT)比色法测定细胞的活力实验分组：不同工作浓度的AGE-BSA (100、200、400μg/mL)作用内皮细胞48h(本论文的所有BSA、 AGEs、 GLP-1的浓度除非特别说明,否则均指工作浓度；以浓度或时间代表不同分组,下同)；200μg/mL AGE-BSA分别作用内皮细胞12、24、36、48h；不同浓度GLP-1(10、50、100、150nmol/L)作用内皮细胞48h;200μg/mLAGE-BSA与不同浓度GLP-1(0、10、50、100、150nmol/L)共同作用内皮细胞48h。将细胞接种于96孔板中,随机进行实验分组处理后,每孔加MTT溶液20μL,4h后吸除培养基,加入二甲亚枫(DMSO),选择570mm波长测吸光度以判断细胞活力。同时,设不加细胞只加培养液的空白对照孔,比色时以空白孔调零。MTT比色法所测的吸光度反映细胞的损伤情况。4.分别用Wright’s-Giemsa染色及吖啶橙、Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学变化。5.流式细胞仪分析凋亡实验分4组,分别为阴性对照组、200μg/mLAGEs、100nmol/LGLP-1组、200μg/mLAGEs+100nmol/LGLP-1组,作用内皮细胞10h。收集实验各组细胞,离心后弃上清,加PBS洗二次,吹散沉淀细胞,加入Annexin V和碘化丙啶(P1)避光放置15min,流式细胞仪上样检测,Cell Quest软件分析细胞早期凋亡率。统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。相关分析采用Spearman相关分析法。凋亡率采用析因设计的方差分析。P<0.050具有统计学意义。结果1.不同浓度AGEs对细胞活力的影响100.200.400μg/mLAGEs作用HUVECs48h后,OD值分别为0.29±0.03,0.13±0.03,0.07+0.02,均显著低于阴性对照组(400μg/mLBSA)(0.42±0.03)和正常对照组(control)(0.40±0.02)(P=0.000)。AGEs的浓度(100.200.400μg/mL)与HUVECs的OD值存在显著负相关关系(r=一0.931,P=0.000)。2.比较AGEs不同作用时间对细胞活力的影响200μg/mL AGEs作用时间(12h、24h、36h、48h)后的细胞OD值分别为0.27±0.03,018±0.02,0.16±0.02,0.12±0.03,均显著低于control组的OD值(0.38±0.02)(vs.control, P=0.000)。AGEs作用时间与细胞活力间存在显著负相关关系(r=-0.956,P=0.000)。3.不同浓度GLP-1单独处理48h对HUVECs活力的影响50.100,150nmol/L GLP-1三组的OD值分别为0.42±0.03、0.50±0.02、0.51±0.04,均显著高于control组的OD值(0.39±0.02)(vs.control, P=0.000),但10nmol/LGLP-1组(0.38±0.03)与control组相比无统计学差异(P=0.907). Spearman相关分析发现,GLP-1浓度(10.50.100.150nmol/L)与细胞OD值间存在显著正相关关系(r=0.820,P=0.001)。4.研究不同浓度GLP-1(10.50.100.150nmol/L)拮抗200μg/mL AGEs对HUVECs的活力影响AGEs组的OD值为0.09±0.02,与阴性对照组(0.38±0.01)相比,有显著差异(P=0.000)。AGEs+GLP-1组在10.50.100.150nmol/L GLP-1四种浓度下的的OD值依次为0.11±0.02、0.14±0.01、0.22±0.03、0.23±0.02,分别与AGEs组相比较,结果显示除了AGEs+10nmol/LGLP-1组的OD值与AGEs组相比无显著差异之外(P=0.932),50.100.150nmol/L GLP-1三组OD值均显著高于AGEs组(AGEs组vs.50nmol/LGLP-1+AGEs组,P=0.036;vs.100.150nmol/LGLP-1+AGEs组,P=0.000)。AGEs组、四个不同浓度的AGEs+GLP-1组的OD值均显著低于对照组(P=0.000)。Spearman相关分析发现,GLP-1浓度(10、50、100、150nmol/L)与HUVECs的OD值间存在显著正相关关系(r=0.885,P=0.000)。5.细胞形态学变化各组经药物干预48h后,Wrihgt’s-Gimesa染色结果显示,阴性对照组与GLP-1组的HUVECs细胞无显著差异,细胞核呈均匀淡染；AGEs组细胞质固缩,细胞核皱缩、致密浓染；AGEs+GLP-1联合处理组细胞核浓染、固缩的细胞较AGEs组明显减少。吖啶橙和Hoechst33258染色后荧光显微镜下观察：阴性对照组HUVECs染色质呈均匀荧光；AGEs组的细胞质固缩,核致密浓染或裂解呈颗粒状,核染色质边集；AGEs+GLP-1联合处理组核浓染、固缩及核碎裂的细胞较AGEs组明显减少。6.Hoechst33258染色计数法检测凋亡率各组细胞经药物作用48h后,AGEs组的凋亡细胞百分率为(22.07±2.20)%,显著高于阴性对照组(7.23±1.00)%(P=0.000),同时亦显著高于AGEs+GLP-1组(16.33±1.23)%(P=0.001)。GLP-1组与阴性对照组相比无显著差异(P=0.112)。7.流式细胞术检测细胞早期凋亡率各组细胞经药物作用10h后,AGEs组的早期凋亡细胞百分率为(20.56±1.16)%,显著高于阴性对照组(7.07±0.65)%(P=0.000),同时亦显著高于AGEs+GLP-1组(13.28±1.19)%(P=0.001)。 GLP-1组的凋亡率为(4.92±0.39)%,显著低于阴性对照组(P=0.020)。结论AGEs呈剂量、时间依赖性诱导血管内皮细胞凋亡。一定浓度范围(50～150nmol/L) GLP-1单独处理血管内皮细胞时,随作用浓度增加,细胞活力增加。首次发现GLP-1在一定的浓度范围(50～150nmol/L)内有拮抗AGEs抑制HUVECs活力的作用,而且可减少AGEs诱导的内皮细胞凋亡。第二部分GLP-1抑制糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡的机制第一节GLP-1对AGEs诱导内皮细胞的氧化应激和caspase家族主要酶的影响目的通过激光共聚焦检测细胞氧化应激水平,并采用酶联反应法测定caspase-9、-3活性,探讨GLP-1在内皮细胞发挥抗凋亡作用的机制。方法1.激光共聚焦检测活性氧(ROS)2. ELISA法检测细胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3活性各组细胞孵育48h,消化、离心后、用细胞裂解液重悬,再加入对应的反应底物。37℃水浴2h后,加样至96孔培养板,最后用酶联免疫检测仪测OD值,检测波长为405nm。统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。此部分的结果均采用析因设计的方差分析。P<0.050具有统计学意义。结果1.GLP-1抑制AGEs诱导的细胞内ROS生成HUVECs阴性对照组的荧光值为30.58±2.20。 AGEs作用48h后细胞的荧光值为60.83±2.14,显著高于对照组(P=0.000)。 AGEs+GLP-1组的荧光值为36.70±1.17,显著低于AGEs组(P=0.000),仍高于对照组,且差异有统计学意义(P=0.000)。析因方差分析显示,AGEs与GLP-1两种干预之间有交互作用(F=51.174,P=0.000)。2.GLP-1对AGEs诱导caspase-9、-3的活性的影响各组细胞经干预48h后,AGEs组的caspase-9、-3显著高于各自的对照组(P=0.000,0.000)和AGEs+GLP-1组(P=0.036,0.006),而GLP-1可部分减轻AGEs诱导caspase-9、-3活性的增加。析因方差分析显示,AGEs与GLP-1两种干预之间有交互作用(F=68.549, P=0.000; F=42.132, P=0.000)。结论AGEs作用于内皮细胞48h后,细胞内ROS水平升高,凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加,GLP-1可部分减少AGEs诱导的这些效应。因此推测氧化应激、caspase-9、-3可能参与了GLP-1拮抗AGEs诱导细胞凋亡的作用。第二节GLP-1对AGEs诱导的PI3K/Akt信号通路的影响目的研究GLP-1对PI3K/Akt信号通路及其下游Bcl-2、 Bax、cyto-c蛋白表达的影响,以期进一步探讨GLP-1减轻AGEs所致细胞凋亡的分子机制。方法1.MTT比色法测定细胞活力(同第一章)2. Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡(同第一章)3. Western blotting法检测细胞p-Akt、 Bcl-2、 Bax、 cyto-c蛋白的表达收集各组细胞,根据蛋白提取试剂盒操作,分别提取各组细胞总蛋白及核蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本20μg,以12%SDS-PAGE进行电泳,转膜后5%脱脂奶粉封闭2h,洗膜后加入BSA-TBS稀释的抗磷酸化Akt (Ser473)多克隆抗体(1：2000)、抗Bcl-2单克隆抗体(1：1000),抗Bax(1：2000)单克隆抗体,抗cyto-c (1:2000)单克隆抗体,4℃孵育过夜,再次洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：5000)杂交1h,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,结果用ImageJ分析软件对目的条带进行灰度值分析。统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,计量实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。相关分析采用Spearman相关分析法。P<0.050具有统计学意义。结果1.LY294002对GLP-1拮抗AGEs抑制HUVECs活力的影响AGEs诱导内皮细胞48h的OD值为0.11±0.03,与对照组(0.39±0.03)相比,有显著差异(P=0.000)。GLP-1与AGEs同时加入,其细胞OD值为0.22±0.03,显著高于AGEs组(P=0.001)。LY294002预处理组的OD值为0.16±±0.02,与AGEs+GLP-1组相比显著降低(P=0.030)。2.LY294002对GLP-1拮抗AGEs诱导细胞凋亡的影响各组细胞经干预作用10h后,AGEs组的早期凋亡细胞百分率为(20.89±±2.67)%,显著高于对照组(6.07±±1.77)%(P=0.000),同时亦显著高于AGEs+GLP-1组(11.77±±2.50)%(P=0.002)。LY294002预处理组的凋亡率为(16.69±2.06)%,显著高于AGEs+GLP-1组(P=0.045)。3.LY294002对AGEs诱导内皮细胞p-Akt水平的影响200μg/mL AGEs处理48h,细胞p-Akt水平(0.39±±0.04)低于对照组(0.46±±0.03),差异有统计学意义(P=0.039)。 GLP-1和AGEs同孵育的内皮细胞,p-Akt表达水平(0.51±±0.03)明显升高,为AGEs单独处理细胞的1.3倍(P=0.003)。100nmol/LGLP-1单独处理组的p-Akt表达(0.644±0.06)显著高于对照组(P=0.000)。析因方差分析显示,AGEs与GLP-1两种干预之间有交互作用(F=52.244,P=0.000)。PI3K阻断剂LY294002预处理可明显抑制AGEs+GLP-1组升高的p-Akt表达(P=0.030)。4.GLP-1对HUVECs的p-Akt水平的影响不同浓度(0、10、500、100nmol/L) GLP-1孵育HUVECs48h后,p-Akt灰度值分别为0.48±0.05,0.48±0.03,0.56±0.02,0.66±0.04。10nmol/LGLP-1组的p-Akt灰度值与对照组相比无显著差异(P=0.947),而50、100nmol/L GLP-1组的p-Akt灰度值均显著高于对照组(P=0.022,0.000).Spearman相关分析结果显示,GLP-1浓度(10、50、100nmol/L)与HUVECs的p-Akt灰度值间存在显著正相关关系(r=0.945,P=0.000)。5.LY294002对GLP-1与AGEs干预下HUVECs的Bc1-2、Bax、cyto-c蛋白表达的影响各组细胞经干预作用48h后,AGEs组Bax蛋白表达量显著高于对照组(P=0.000),而Bcl-2蛋白表达与对照组相比无显著差异(P=0.958),故Bcl-2/Bax比值显著低于对照组(P=0.000)。 AGEs+GLP-1联合处理HUVECs48h后,细胞的Bcl-2蛋白表达水平明显高于AGEs单独处理组(P=0.008),而Bax水平显著低于AGEs组(P=0.000),故Bcl-2/Bax比值较AGEs显著提高(P=0.000)。LY294002的预处理部分减弱了GLP-1抑制Bax升高的作用(P=0.004vs. AGEs+GLP-1组),而对Bcl-2水平无显著影响(vs. AGEs+GLP-1组,P=0.139),LY294002预处理组的Bcl-2/Bax比值较AGEs+GLP-1组显著降低(P=0.000)。AGEs组cyto-c水平(1.48±0.05)显著高于对照组(P=0.000)。 AGEs+GLP-1联合处理HUVECs48h后,细胞的cyto-c释放水平(1.01±0.03)明显低于AGEs单独处理组(P=0.000)。 PI3K抑制剂LY294002预处理细胞1h后,GLP-1减少cyto-c释放的作用被部分抑制(1.29±0.04)(vs.AGEs+GLP-1组,P=0.000)。结论本部分实验首次证明GLP-1至少部分通过激活PI3K/Akt信号转导通路发挥抗凋亡作用,减轻了AGEs诱导的血管内皮细胞凋亡。我们还首次发现GLP-1可调节AGEs诱导内皮细胞Bcl-2、 Bax、 cyto-c表达水平,且此调节作用与PI3K/Akt信号通路有关。