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研究意义和目的艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是严重影响人类健康的全球公共卫生问题,抗反转录病毒治疗(Antiretroviral therapy,ART)可抑制HIV复制,降低病毒载量,提高感染者的预期寿命,并减少新发感染。但ART不能彻底清除HIV,病人需要终身服药,可能会因药物不良反应、经济水平、心理因素等原因导致依从性不好,而停药则是依从性不好的极端表现之一。目前国内应用二代测序技术对停药期间耐药特征的研究尚不多见,也少有其影响再治疗效果的报道。本研究将通过建立基于二代测序的HIV基因型耐药检测方法,研究停药病人的耐药毒株变化及对后续治疗的影响,为抗病毒治疗的可持续性提供基础数据。研究方法1、本研究采用酶切法构建测序文库,初步建立基于Illumina Miseq二代测序平台的HIV基因型耐药突变位点检测方法。2、选取病毒载量≥1000拷贝/mL的25份HIV 阳性血浆样本,通过文库的均一性、测序深度和覆盖率评价方法的可行性;根据扩增灵敏度、与一代测序序列的核苷酸一致性、批内和批间一致性,评价该检测的准确性、精确性和可重复性。3、采用基于一代和二代测序的基因型耐药检测方法平行检测332份样本,以一代测序结果为标准,评价不同检测阈值下,二代测序法检测耐药突变的灵敏度、特异性等,进一步对该基因型耐药检测方法进行验证。4、通过横断面调查,于2016年我国部分地区纳入停止抗病毒治疗的211名HIV/AIDS病人,利用二代测序检测5%和20%阈值时位点突变情况,对研究对象的调查数据及停药后耐药位点的变化情况进行分析5、通过回顾性队列调查,观察在河南确山和安徽阜阳两县市的64名停止ART的HIV/AIDS病人,分析病人停药前后病毒载量、CD4+T淋巴细胞数及艾滋病病毒耐药变化情况,以及再治疗病人的病毒抑制情况及影响因素。研究结果一、建立和评价基于二代测序的HIV耐药检测方法采用酶切法构建文库建立了基于二代测序的HIV耐药检测方法。该方法的平均测序深度为109798×,最低测序深度为10000×,可覆盖PR和RT区具有临床意义的耐药突变位点对应的基因区域。本研究中,NGS能检出Sanger测序检出的所有突变位点,当位点突变频率高于10%时,两种测序方法的检测结果完全一致;同一样本的4次重复试验结果间无差异;野生株pNL4-3质粒的可重复性结果显示无额外突变的存在,表明该方法较稳定。当阈值设为1%或5%时,基于一代及二代测序的检测方法间具有统计学差异,1%阈值时,两方法间的一致性较低(κ=0.0941),随着阈值从1%升高到20%,二代测序的敏感度随之降低,而特异性从16.7%上升到94.7%。此外,5%以上阈值的二代测序结果中无非特异性突变位点如K65ER、D67GEN、F77L、L100VI的存在,但在1%阈值下出现频率较高。耐药结果显示1%阈值的NGS可检测到56.9%没有被SS检测到的突变位点,但3.6%的病人耐药位点突变频率在20%以上却只被NGS检测到;有0.9%的病人耐药位点未被NGS检测到而是被SS检测到,主要是由混合碱基引起的。二、2016年部分地区停药病人耐药情况的横断调查结果分析横断面调查共纳入211例停药的HIV/AIDS病人,在2010-2014年间接受ART,停药前服用的药物以含3TC的一线药物为主。有174名停药病人的病毒载量≥1000拷贝/mL。耐药结果显示55(26.1%,55/211)例病人出现耐药突变位点,耐药位点以 M46VI、K65R、K103N、E138AG、G190AE 为主。停药 1-12个月病人中有80.7%的人病毒载量≥1000拷贝/mL,停药12个月及以上病人的病毒载量≥1000拷贝/mL的比例为84.3%。其中停药1-12个月的病人中有27.5%人携带耐药位点,而停药12个月及以上的病人中有24.5%人携带耐药位点。停药时间与病毒载量,耐药率的卡方检验结果显示,停药时间越长,病毒载量≥1000拷贝/mL的比例就越高(p<0.0001),而耐药率越低(p<0.0001)。此外,结果显示HIV/AIDS病人停药1-12个月后可以检测到PIs突变位点如D30N、M46VI、Q58E、N88D,NRTIs 突变位点如 K65R、D67G,以及NNRTIs 突变位点 K103N、V106AM、E138AG、V179DE、G190AE、Y188CL、P225H;病人停药 12 个月及以上时仍存在的位点有 M46VI、K65R、K103N、E138AG、V179DE、G190AE 和 Y188CL等。三、河南安徽部分最早接受抗病毒治疗的停药病人的耐药情况分析本部分研究纳入的停药病人于2003-2004年开始接受ART,停药前治疗方案以早期一线方案(AZT/d4T+ddI+NVP)为主。停药前有64人,停药12个月和24个月后分别随访到52人和40人。按世界卫生组织(WHO)标准,治疗后病毒载量在1000拷贝/mL以下的为病毒抑制。将病人按停药前的病毒载量分成两组,病毒载量低于1000拷贝/mL为病毒抑制组,高于或等于1000拷贝/mL为病毒未抑制组。结果显示病毒抑制组的30名病人停药后12个月和24个月病毒载量≥1000拷贝/mL所占比例分别是84.0%(21/25)、100.0%(21/21);病毒未抑制组的病人停药后病毒载量仍在1000拷贝/mL以上。停药病人CD4+细胞中位数由停药前的285(IQR 175-443)个/μL分别下降为停药12个月和24个月后的223(IQR 111-345)、282(IQR 177-348)个/μL。结果显示NRTIs中耐药位点以K65RE为主,它和V75TIA和Q151M位点在停药12个月后仍然存在,而M41L、K70N、L74V、F116Y、K219E等耐药位点在停药12个月后便消失;NNRTIs耐药位点出现最多的是K103N(95.2%)、Y181C(38.1%)和G190A(19.1%),随着停药时间的延长这些耐药位点逐渐减少,但停药24个月后仍可检出,有些耐药位点(如K101E、H221Y、F227L、M230I、K238NT和Y188L)在停药12月或24月时已检测不到。单个氨基酸突变进化压力及协同突变分析结果显示突变位点L74V和V75T的消失分别与位点K103N、Y188L有关,此外,L74V、Q151M和T215Y均受位点Y181C的影响。结合回顾性队列随访中停药病人位点消失情况发现,突变位点L74V和Y181C一起消失的占9.5%;突变位点Q151M和Y181C一起消失的占4.8%,同样有4.8%的病人其T215Y位点和K103N、Y181C突变位点一起消失。再次治疗后病毒抑制情况的COX回归模型结果显示停药病人的性别、停药时长及ART方案是病人再治疗后病毒抑制的影响因素。虽然再治疗前病人所携带的突变频率在5%以上的位点对停药病人再治疗后的病毒抑制情况无影响,但5%阈值对NRTIs和NNRTIs均耐药的停药病人再治疗后有病毒抑制率较低的趋势。研究结论1.酶切法构建的测序文库在pol基因区域分布均匀,可满足基于二代测序法的HIV耐药基因型检测的要求。2.建立的基于二代测序的HIV基因型耐药检测方法,其准确度、可重复性和精确性较好。与一代测序结果比较,在5%阈值时准确性、敏感度和特异性均较高,可检出低频耐药位点。3.接受ART的HIV/AIDS病人停药后,其体内的病毒载量升高而CD4+细胞数下降。突变位点如K65R、L74V、V75T、Q151M、Y188L、H221Y等随停药时间逐渐消失,且L74V、Q151M与Y181C突变位点一起消失,而K103N、E138A和G190A等NNRTIs突变位点可在停药12-24月后仍存在,但位点突变频率随停药时间延长而下降。4.停药病人的性别、停药时长及ART方案是病人再治疗后病毒抑制的影响因素。