白背飞虱[Sogatella furcifera(Horváth)](半翅目Hemiptera,飞虱科Delphacidae)是一种严重危害水稻的迁飞性害虫。由于特殊的喀斯特地形地貌和适宜气候条件对白背飞虱的迁入和发生均为有利,贵州白背飞虱的发生呈逐年加重的趋势。白背飞虱的防治长期以化学防治为主,以致白背飞虱对多种杀虫剂产生了严重的抗药性。由于有关贵州省白背飞虱对常用杀虫剂抗性的已有研究缺乏与相对敏感基线的比较,因此,其抗药性现状及水平仍不能明确,抗药性进一步发展的风险高。烯啶虫胺作为防治白背飞虱的药剂已在水稻上大面积推广,环氧虫啶以其对白背飞虱的卓越防效而即将成为主推药剂。随着两种杀虫剂的大面积使用与推广,势必面临抗药性问题。目前,尚未有关于白背飞虱对烯啶虫胺、环氧虫啶这两种杀虫剂抗药性分子机理的报道。鉴于上述原因,本研究连续监测了白背飞虱种群抗药性的发展动态,运用转录组分析+实时荧光定量的方法,探讨了白背飞虱在烯啶虫胺、环氧虫啶两种杀虫剂诱导下的分子响应相关机制,以期为进一步研究抗药性机理奠定基础。1贵州省白背飞虱的抗药性水平现状分析于2015年6月-7月采集贵州省8地(玉屏县、黔西县、平塘县、播州区、平坝县、花溪区、务川县、兴仁县)的白背飞虱若虫或成虫,于室内饲养1代后,采用稻茎浸渍法测定3龄若虫对毒死蜱、异丙威、吡虫啉、噻嗪酮、吡蚜酮、噻虫嗪、烯啶虫胺等7种杀虫剂的敏感水平,并与相对敏感基线进行比较。结果显示:贵州省白背飞虱对噻嗪酮(抗性倍数在11.4-167.6之间)、吡蚜酮(抗性倍数在20.8-84.7之间)均已产生中至高水平抗性;对毒死蜱和吡虫啉为中等水平抗性;对异丙威、噻虫嗪、烯啶虫胺则仍敏感。2贵州省白背飞虱对12种杀虫剂的敏感性监测于2012年6-8月至2015年6-8月,分别在花溪、平坝、播州、黔西、平塘、玉屏6地采集白背飞虱,于室内饲养1代后,取3龄若虫,采用稻茎浸渍法对毒死蜱、敌敌畏、异丙威、甲萘威、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、噻嗪酮、吡蚜酮、吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺、环氧虫啶等12种杀虫剂进行生物测定,比较4年间白背飞虱抗药性或敏感性的动态变化,结果显示:贵州白背飞虱种群对毒死蜱为中等抗性水平的次数占总采样次数的63.64%,对毒死蜱的抗性有进一步增加的风险。对异丙威为敏感降低及敏感水平的次数占总采样次数的100%,对异丙威仍敏感。对噻嗪酮为中等抗性水平及以上的次数占总采样次数90.91%,高等抗性水平的次数占总采样次数59.09%;对吡蚜酮中等抗性水平及以上的次数占总采样次数95.45%,高等抗性水平的次数占总采样次数54.55%。因此,贵州白背飞虱种群对噻嗪酮和吡蚜酮的抗性水平较高。吡虫啉中等水平抗性的次数占总采样次数36.36%,其在贵州仍可用于防治白背飞虱。对噻虫嗪的抗性倍数均低于10倍,低等水平抗性次数占总采样次数90.91%;对烯啶虫胺的抗性倍数均低于10倍,敏感水平次数占总采样次数85.71%。因此,贵州白背飞虱种群对噻虫嗪、烯啶虫胺依然敏感。平坝、播州、黔西和平塘种群对敌敌畏的敏感性有所增加,而花溪和玉屏种群的敏感性有下降趋势。花溪、播州、黔西和平塘种群对环氧虫啶的敏感性均有升高的趋势,而平坝种群的敏感性有下降趋势。对甲萘威的敏感性均为逐年下降。花溪、平坝和黔西种群对高效氯氰菊酯的敏感性有升高的趋势,播州、平塘和玉屏种群的敏感性有下降的趋势。对溴氰菊酯的LC50值均逐年上升,敏感性有所降低。3延缓白背飞虱抗性的农药复配增效配方筛选在田间采集白背飞虱,经饲养1代后取3龄若虫用稻茎浸渍法进行实验。采用共毒因子法、共毒系数法和等效线法设置配比相结合的方法,筛选有增效活性的配方组合。选择复配的单剂包括:毒死蜱、敌敌畏、异丙威、吡蚜酮、吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺和环氧虫啶8种农药单剂。结果为:由8种农药两两组合成的8组复配组合共40组配比中,利用共毒因子法定性筛选出16组共毒因子大于20的配比。在这16组配比中,利用共毒系数法定量筛选出有增效作用的5组配比,分别为烯啶虫胺与毒死蜱按1∶30配比;吡虫啉与异丙威分别按7∶40、7∶200、7∶400和7∶1 000配比;其共毒系数分别为112.5、242.1、212.4、638.1、417.7,其中吡虫啉与异丙威按7∶400配比具有最显著增效作用。4白背飞虱受烯啶虫胺诱导后抗性相关基因的转录组学分析用烯啶虫胺LC10(=0.14mg·L-1)剂量处理白背飞虱5龄若虫48h后,选择初羽化雌成虫进行转录组测序,未处理的作为对照组(登录号分别为SRR5277484和SRR5277485),得到16,337,759个核苷酸,并获得了103,793个Unigenes,其中有44,248条序列(占所有Unigenes总数的42.63%)与至少一个数据库比对上。整个转录组数据中仍有57.37%的序列没有被比对。在烯啶虫胺处理白背飞虱转录组中,共得到编码蛋白框(CDS)核酸序列33,023条;利用ESTscan预测,共得到具有编码区氨基酸序列19,106条。共获得17,310条简单重复序(SSRs),在所有SSRs中有7,802条是单核苷酸重复,占总SSRs的45.07%。其中(T)n是单核苷酸重复中数量最多的重复单元。通过处理组与对照组的比较,得到543个差异表达基因,其中300个上调基因,243个下调基因。通过GO注释,有315个Unigenes被成功注释。在这些差异表达基因中有31个基因与抗药性相关,其中包括细胞色素氧化酶、谷胱甘肽转移酶、酸性磷酸酯酶、钙粘蛋白、三磷酸腺苷合酶等。5白背飞虱受环氧虫啶诱导后抗性相关基因的转录组学分析用环氧虫啶LC10(=0.58mg·L-1)剂量处理白背飞虱5龄若虫48h,同样选择初羽化雌成虫进行转录组测序,未处理的作为对照组(登录号分别为SRR4294200和SRR4294203),得到157,906,456个核苷酸,并获得131,601条Unigenes。其中有38,534条序列(占所有Unigenes总数的29.28%)与至少一个数据库比对上。整个转录组数据中仍有70.72%的序列没有被比对上。在环氧虫啶处理白背飞虱转录组中,共得到编码蛋白框(CDS)核酸序列28,546条。利用ESTscan预测,共得到具有编码区氨基酸序列22,299条。共获得15,868条SSRs,三核苷酸重复数量为7,157条,占总SSRs的45.1%,其中(AAG/CTT)n是三核苷酸重复中数量最多的重复单元。通过处理组与对照组转录组比较,得到了359条Unigenes差异表达基因,其中131个上调,228个下调。其中有217条被成功注释。这些差异表达基因中与抗药性相关的基因有22个,包括细胞色素氧化酶、谷胱甘肽转移酶、酸性磷酸酯酶、钙粘蛋白、糖基转移酶及脱羧酶/脱氢酶等。6白背飞虱受环氧虫啶诱导后抗性相关差异基因的实时荧光定量(qRT-PCR)分析使用环氧虫啶1×,2×,4×,8×LC10浓度处理白背飞虱,各处理分别于0h,24h,48h,72h取初羽化雌成虫作为试虫。在22个与抗药性有关的差异表达基因中选择差异较大的15个基因进行实时荧光定量分析。结果表明:其中5个基因表达量较低,没有扩增;另5个虽有扩增,Ct值也低于34,但是溶解曲线没有单一的峰值,不能特异性扩增。仅5个基因扩增成功,分别被注释为细胞色素P450的CYP4、CYP6;S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶酶源;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶;α-1,3-甘露糖基转移酶。本研究明确了贵州白背飞虱对常用杀虫剂的抗性水平及抗性的发展趋势,获得了多组共毒系数显著大于100的常用杀虫剂增效配方,全面解析了烯啶虫胺、环氧虫啶胁迫下白背飞虱的转录组数据并明确了抗性相关基因。这些成果是白背飞虱防治及抗性治理研究的理论和技术创新,对指导白背飞虱综合治理具有具有重要理论价值和实践意义。