实验医学是推动临床精准医学发展的重要基石,20世纪70年代以来,作为最先进的实验医学技术,分子检测技术的研究经历了半个世纪的发展,已经逐步进入临床应用,并成为实验医学(体外诊断)领域的先进技术的代表。分子检测技术主要包括分子杂交、分子构象、聚合酶链式反应(PCR)和基因测序四大技术,随着技术应用的不断完善、进步和规范,已经广泛用于疾病的防、筛、诊、治等大健康管理,包括临床感染性疾病、肿瘤性疾病、遗传性疾病、优生优育、药物基因组、疾病风险和病程管理等多个领域。特别是分子诊断技术在肿瘤领域的研究与应用已成为肿瘤精准医学的热点,与PCR技术、测序技术密切相关的液体活检,包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体等的检测极大地提升、改善了肿瘤临床精准管理水平和患者预后。本研究以目前最新的三种分子检测技术方法为代表,聚焦下一代基因测序技术(Illumina平台)、数字PCR技术(微滴式数字PCR平台)、循环肿瘤细胞检测(阴性富集加叶酸受体PCR检测平台),探讨这些先进分子检测技术在肝胆肿瘤临床辅助诊断和病程管理中的应用价值。原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)主要的组织学类型包括:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。胆道肿瘤则是由胆道或是胆囊上皮的胆管细胞分化形成的一组异型性的肿瘤,两种肿瘤都在消化系统肿瘤中恶性致死性极高。第一部分:高通量测序分析HBV多耐药位点及HBs Ag+/HBs Ab+相关变异下一代基因测序技术(NGS)在肿瘤精准诊疗中具有重要作用,其检测周期短、通量高、灵敏度高,测序后得到的海量数据结果有利于更深层次的数据分析和挖掘,最终实现患者精准病因学诊断。乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致肝癌发生的最常见病因,目前抗病毒治疗是控制和预防慢性HBV感染患者病情进一步发展的唯一选择。一般认为乙肝病毒表面抗体(HBs Ab)能完全中和乙肝表面抗原(HBs Ag)。然而,临床在慢性HBV感染中会出现HBs Ab和HBs Ag共存现象,本研究通过本院及多中心入组慢性乙型肝炎(CHB)和HBV相关HCC样本共1066例,采用NGS分析患者HBV RT区耐药位点以及S区HBs Ag+/HBs Ab+双阳性患者的序列特征。RT区5种抗病毒药物的耐药分析显示,LAM和Ld T的耐药发生率(低频耐药+耐药)最高为61.66%和61.34%;ETV和ADV药物耐药发生率较低分别为21.25%和15.34%;TDF基因型耐药发生率最低为13.10%。LAM、Ld T、ETV产生耐药(突变率>20%)例数较多;ADV耐药相关的rt S78T、rt A181T/V、rt N236T位点低频突变(突变率5-20%)占阳性突变(突变率≥5%)的比率为59.09%、18.75%、38.46%,TDF的低频耐药占全部耐药的发生率较高为79.27%,而且其耐药相关的rt S78T、rt A181T/V位点低频突变(突变率5-20%)占阳性(突变率≥5%)突变的比率为59.09%、18.75%。HCC和CHB统计差异突变频率时发现,位点rt236、rt184在CHB和HCC组之间存在显著差异(P<0.05)。S区氨基酸突变分布提示,HBs Ag+HBs Ab+双阳性(DP)患者和HBs Ag+HBs Ab-单阳性(SP)患者在主要亲水区(MHR)的平均突变率均高于其他区域,而且在MHR内部的“a”决定簇区域DP组显著高于SP组(P<0.05)。分组分析发现,在HCC组中P46L、L104F、T118P、R/K122T、T125P、I126T、Q129N、T131N、M133S、M133T、V168A、I195M、P203R、Y206C、F220C、V224A的16个位点在DP和SP组的突变率存在显著差异(P<0.05);在CHB组T47K、P62L、L77R、Q101H、M103L、L104F、I126S、M133T、G145R、M198I、L216*的11个位点在DP和SP组的突变率存在显著差异(P<0.05)。在HCC组中16个位点和CHB组的11个位点中,共同的差异位点为M133T和L104F,其余位点则不同;HCC患者的16个差异位点均与HBs Ag结果呈负相关;T125P、L104F、I195M、T118P、R/K122T、Y206C、Q129N、V168A与HBs Ab结果呈负相关,而I126T、V224A、P46L、F220C、M133T、T131N、M133S、P203R与HBs Ab呈正相关。而CHB患者的M103L、L104F、Q101H、G145R、L77R、T47K、P62L、M133T、L216*与HBs Ag结果呈负相关,I126S、M198I与HBs Ag呈正相关;M103L、L104F、Q101H、L77R、G145R、L216*、T47K、M133T、P62L与HBs Ab结果呈负相关,而I126S、M198I与HBs Ab呈正相关。HCC的S区DP和SP组存在差异的16个位点P46L、L104F、T118P、R/K122T、T125P、I126T、Q129N、T131N、M133S、M133T、V168A、I195M、P203R、Y206C、F220C、V224A的突变频率与血清HBs Ag中和率的相关性分析结果显示,Q129N差异位点的突变频率与中和率之间存在负相关性(r=-0.41,P<0.05)。综上,本研究利用NGS技术分析了临床标本的RT区耐药位点和S区HBs Ag/HBs Ab双阳性相关突变情况。耐药定量检测是本研究的优势,且低频(5-20%)耐药的发现对于未来耐药发生具有重要预测价值,定量及超敏耐药检测以及HCC、CHB差异耐药位点的存在为临床提供了用药指导以实施更精准的抗病毒治疗;HBs Ag+HBs Ab+双阳性患者HBV的S区变异分析提示,HCC和CHB在疾病进展中可产生不同的突变,HCC患者的差异位点主要集中在“a”决定簇区域,并影响着HBs Ag和HBs Ab的中和反应,导致新的HBV重叠感染。这些突变的发现可能是HBV免疫逃逸、发生HBV传播甚至已接种疫苗人群感染的重要原因。第二部分:数字PCR定量检测TP53基因p.R273H突变对胆道肿瘤诊断和预后的初步临床研究数字PCR技术(d PCR)在微量核酸样本的微小突变差异检测方面的优势被普遍认可,我们利用d PCR技术对胆道肿瘤患者人体抑癌基因TP53的突变情况进行检测,并探索讨论其在临床中的应用价值。我们对人类癌症突变信息数据库网站(COSMIC)现有数据TP53基因中的胆道肿瘤进行分析,发现多个肿瘤驱动基因热点突变位点(p.R175H、p.R248Q、p.R248W、p.R273H)的突变率普遍较高。本研究将上海东方肝胆外科医院检验科样本库中现有保存的胆道系统肿瘤及其肿瘤旁组织共45对,分别DNA抽提后,利用微滴数字PCR(dd PCR)技术,对位点p.R175H、p.R248Q、p.R248W、p.R273H进行定量检测;对样本库中现存的血浆样本中76例胆道肿瘤患者作为实验组,40例胆囊炎患者作为疾病对照组,40例健康人作为健康对照组,血浆标本分别抽提游离DNA(cell free DNA,cf DNA)并进行4个突变位点的dd PCR检测。45对胆道肿瘤患者肿瘤与肿瘤旁组织的TP53基因突变位点定量分析表明,胆道肿瘤组织中的p.R175H位点突变率(%)与其肿瘤旁组织比较差异有统计学意义(P<0.05),其余位点p.R273H、p.R248W、p.R248Q配对比较差异均无统计学意义(P>0.05)。进一步根据有无p.R175H突变比较两组患者临床指标差异,观察发现白蛋白和总蛋白指标在两组患者中有显著差异(P<0.05),有p.R175H突变的患者这些指标都低于没有突变的患者。外周血cf DNA TP53研究表明,76例胆道肿瘤患者和40例胆囊炎患者血浆标本p.R273H位点突变频率(%)在胆囊癌、肝内胆管癌、胆道肿瘤组高于疾病对照组、疾病对照组+健康对照组(P<0.05)。进一步结合病理特征包括肿瘤大小、数量、是否转移以及TNM分期等重要肿瘤特征显示,p.R273H突变与肿瘤数量相关(P<0.05),p.R248W、p.R248Q、p.R175H突变与肿瘤数量无关(P>0.05)。联合p.R273H、CA19-9、AFP三项的二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.547时,对胆道肿瘤诊断敏感度为73.7%,特异度为90.0%,曲线下面积为0.845[95%CI(0.775～0.914)]。基于p.R273H、CA19-9二项联合二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.177时,对胆囊癌诊断敏感度为79.2%,特异度为95.0%,曲线下面积为0.908[95%CI(0.831～0.985)]。基于p.R273H、p.R248W、CA19-9、AFP四项联合二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.47时,对ICC诊断敏感度为75.0%,特异度为90.0%,曲线下面积为0.844[95%CI(0.764～0.924)]。生存曲线分析显示,与胆道肿瘤中p.R273H突变位点阴性患者相比,阳性患者的生存率显著降低(P<0.05)。综上,本研究基于d PCR技术的TP53基因突变分析,对胆道系统肿瘤的诊断和预后分析具有一定的临床意义。p.R273H突变定量检测可以有效提高胆道肿瘤的诊断效能,并可作为患者术后预后判断的有效指标。第三部分:循环肿瘤细胞检测技术在肝胆肿瘤临床诊断中的初步应用循环肿瘤细胞(CTC)检测技术作为液态活检中有效的实时监测方法,分离得到的细胞具有肿瘤的"完整"标记物,是目前肿瘤诊断研究领域的前沿技术。研究发现叶酸受体(FRs)在肿瘤组织中高表达,已有研究将FRs作为肿瘤特别是肺癌患者CTC检测的靶点并进入临床研究,在肝胆等多种肿瘤中是否可作为CTC检测的靶点有待进一步研究或询证验证。本研究聚焦肝胆肿瘤患者外周血以及组织中FRs表达情况。我们收取2020年于上海东方肝胆外科医院就医的肝胆肿瘤患者全血标本28例,疾病对照14例,健康对照组14例作为CTC研究实验对象;另挑选45对2012-2014年来自本科室样本库中的HCC及胆道肿瘤患者的肿瘤组织及其匹配肿瘤旁标本,研究叶酸受体蛋白组织中表达情况。结果发现,每3m L血液中叶酸受体数量在肝胆肿瘤中明显高于对照组标本(P<0.05)。30对肿瘤组织中叶酸受体α的m RNA表达水平显著高于肿瘤旁组织(P<0.05);在HCC组中叶酸受体m RNA表达水平与糖类抗原19-9(r=0.636,P<0.05)、G谷氨酰转移酶(r=0.477,P<0.05)、天门冬氨酸转移酶具有相关性(r=0.5,P<0.05)。蛋白质印迹(30对组织)和免疫组化法(45对组织)分析肝胆组织的肿瘤和肿瘤旁中叶酸受体α蛋白具有显著差异(P<0.05)。综上,本研究结果提示,叶酸受体作为CTC的靶标可能也适用于肝胆肿瘤患者的血液检测,但对于预后评估的价值有待于进一步研究。与肿瘤旁对照组织相比,肝胆肿瘤组织中存在叶酸受体α的表达,其病理意义值得进一步研究。