基因编辑技术指有意识的对目标DNA序列进行单个或者多个碱基的插入、删除以及突变的一项技术。近年来,研究者们探索出了许多高效的基因编辑工具,从而使得对基因的编辑变得简单方便,例如两种基于核酸内切酶的ZENs（锌指核酸酶）和TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）技术,以及CRISPR/Cas9、Cas12a系统介导的编辑技术。2013年以来,使用CRISPR/Cas9以及随后出现的CRISPR/Cas变体对基因进行改造成为热门。Cas蛋白是一种由RNA介导的核酸内切酶,该RNA为特异性的sg RNA（单链引导RNA）,在其引导下从而能够对靶DNA序列切割使其发生断裂。CRISPR/Cas系统因其高效性,易操作性和准确性等性质而广泛用于体内、外基因编辑,它可用于在单个基因中同时添加所需和删除等位基因。在本论文中,我们研究了一种来自于新弗朗西斯菌的可编程核酸内切酶,FnCas12a（CRISPR from Prevotella and Francisella,也被称为Cpf1）的酶学性质,结果表明融合CL7标签的FnCas12a能够在1-5分钟内对靶序列进行完全切割,具有很高的切割效率和专一性。同时,本论文的结果表明FnCas12a识别5’-TYN-3’的PAM（间隔区邻接序列）,并在目标链和非目标链上距离PAM约15-24nt的位置随机进行切割,每条链上的切割位点超过5个,因此产生1-8nt的非均一的5’-粘端。为了利用FnCas12a进行体外基因编辑,本论文引入T5核酸外切酶对FnCas12a切割产生的DNA片段末端进行修理,并据此发展了基于FnCas12a和T5核酸外切酶的体外定点诱变系统,称为CT5-SDM（FnCas12a and T5 exonuclease mediated site-directed mutagenesis system）。该方法的实验步骤主要是:（一）使用FnCas12a RNP对携带有待突变基因的质粒在待突变位点附近进行单酶切,使目标核苷酸位于切割产生的粘性末端上。（二）加入适量的T5核酸外切酶以切除包括目标核苷酸在内的5’-粘性末端,并形成20-30nt的ss DNA同源末端。（三）快速加入含有所需突变碱基的单链或者双链寡核苷酸片段（四）在混合物中加入大肠杆菌克隆菌株并通过同源配对将质粒环化,质粒上携带的缺口在大肠杆菌宿主细胞中得到修复。本研究表明,利用双链寡核苷酸片段介导突变时,CT5-SDM的突变效率可达到82.7%;利用单链寡核苷酸片段介导突变时,突变效率达到51.5%。同时,该定点诱变方法可以用于大于10kb的载体的突变,其双链突变效率达到43%,单链突变效率达到22%。进一步的研究表明单链寡核苷酸片段介导CT5-SDM的原理与双链寡核苷酸片段不一样,前者利用的是大肠杆菌胞内的同源重组系统。本论文的结果表明CT5-SDM方法中,大肠杆菌胞内进行ss DNA介导的同源重组时,不需要噬菌体同源重组系统的辅助和高浓度的寡核苷酸。本论文建立的定点诱变技术为合成生物学、蛋白质工程等领域提供了更加有效的方法。同时,FnCas12a和T5核酸外切酶联用的方法也为基因克隆提供了新思路。