乳杆菌代谢产物RNA组分对HT-29细胞和小鼠肠道Toll样受体通路的影响

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目的:1.探索乳杆菌代谢产物RNA组分对TLRs通路的影响。2.研究乳杆菌代谢产物RNA组分对肠道菌群失衡模型小鼠肠道菌群恢复的影响。方法:1.RNA组分对人结肠腺癌细胞系HT-29细胞Toll样受体通路的影响(1)调整HT-29细胞浓度,并分为三组,阴性对照组、实验组、阳性对照组。实验组加入RNA组分,阳性对照组加入CPG-ODN2006,培养48h。(2)RT-PCR方法检测TLR9.NF-KBp65的变化;ELISA法检测HT-29细胞培养液中IL-6的变化。2.RNA组分对小鼠肠粘膜上皮细胞Toll样受体通路的影响(1)采用抗生素头孢曲松钠灌胃的方式建立小鼠肠道菌群失衡模型后,以RNA组分5mg/kg/天、7.5mg/kg/天、10mg/kg/天的剂量,连续3天灌胃调节,并从灌服之日起每7天检测一次各免疫指标。(2)RT-PCR方法检测TLR9.TLR4.TLR2.NF-KBp65的变化;免疫组织化学方法方法检测TLR9和NF-KBp65的变化。(3)ELISA法检测小鼠全血中IL-6的变化;检测小鼠外周血常规的变化;3.菌群分析法检测小鼠盲肠内容物菌群变化。结果:1.RNA组分对人结肠腺癌细胞系HT-29细胞Toll样受体通路的影响(1)与对照组相比,RNA组分组TLR-9表达量略高于阴性对照组,低于阳性对照组。NF-κBp65表达量亦为实验组略高于阴性对照组,低于阳性对照组。(2)与对照组相比,RNA组分组HT-29细胞培养液中IL-6的表达量高于阴性对照组(P<0.05),低于阳性对照组(P<0.05)。2.RNA组分对肠粘膜上皮细胞Toll样受体通路的影响(1) RT-PCR结果表明,正常小鼠IECs内TLR9表达量极低,失衡模型小鼠TLR9表达量大幅升高。经RNA组分处理后,TLR9表达量呈明显回降趋势。随RNA组分作用浓度增加,TLR9表达量回降明显,且作用时间越长,回降的效果越好。本实验中RNA组分(10mg/kg/天)组恢复21天时效果最好。TLR9免疫组化结果与RT-PCR结果一致,10mg/kg/天RNA使失衡小鼠TLR9蛋白表达量回降。(2)与正常小鼠相比,失衡模型小鼠TLR4表达量略有升高,经RNA组分处理后,TLR4表达量恢复。失衡模型小鼠TLR2表达量明显升高,经RNA组分处理后,总体呈回降趋势,但表达量仍高于正常小鼠。(3) RT-PCR和免疫组化实验证明,正常小鼠NF-κBp65呈低表达,失衡模型小鼠NF-κBp65表达量大幅升高,待RNA组分调节21天后,NF-κBp65表达量下降。(4)与正常小鼠相比,失衡模型小鼠血中IL-6含量显著升高,经RNA组分作用7天,14天,21天,IL-6含量明显低于失衡模型(P<0.05),呈逐渐恢复趋势。(5)失衡模型小鼠与正常小鼠比较,盲肠指数明显增高,经RNA组分调节后,盲肠指数呈降低趋势。随作用浓度和时间的增加,降低效果明显。(6)失衡小鼠经RNA组分调节后,肠道中乳杆菌最先恢复正常水平(P>0.05),21天时除酵母与消化球外,各菌群均已得到恢复(P>0.05)。(7)自然恢复组白细胞的表达量总体呈持续升高趋势,RNA组分干预能遏止白细胞表达量的过度升高。分叶核细胞百分比经RNA组分调节后,处于持续回降趋势,总体低于自然恢复组,21天基本恢复到正常水平。血小板数在实验组与自然恢复组变化趋势与幅度基本一致。结论:1.乳杆菌代谢产物RNA组分对TLR通路具有调节作用。2.乳杆菌代谢产物RNA组分具有恢复失衡小鼠优势菌群作用。3.乳杆菌代谢产物RNA组分对外周血常规指标及免疫分子IL-6具有的调节作用。
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