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目的Nek2及其剪接异构体Nek2A作为一种中心体相关激酶,是中心体正确地复制、分离、成熟和建立双极纺锤体所必须的。本研究采用临床病理学与细胞生物学相结合的研究方法,从不同角度研究中心体调控因子Nek2及其剪接异构体Nek2A在乳腺癌多个阶段发生发展过程中的作用。首次大样本地分析了Nek2及Nek2A的表达并分析其与乳腺癌患者临床病理学指标的关系,并在代表乳腺癌不同病变阶段的人类乳腺癌发生模型MCF10细胞系(乳腺正常细胞系MCF10A.导管内癌细胞系MCF10DCIS.com和浸润性癌细胞系MCF10Cal)中初步探讨了Nek2及Nek2A基因调节中心体的分子机制。该研究是一个临床患者资料和基础细胞生物学相结合的系统性应用型研究,为乳腺癌的早期诊断和个体化治疗提供了理论基础。方法在临床患者组织样本中采用免疫组化S-P法检测348例乳腺浸润性导管癌,137例伴发的导管内癌,60例导管内癌和137例乳腺正常组织(作为对照组)中Nek2蛋白的表达,比较Nek2蛋白表达水平在不同病变的差异,并分析其与患者临床病理学特征的关系。同时检测中心体的另外一个调节因子也是中心体之间的连接成分β-catenin,来初步探讨Nek2的作用机制。利用半定量RT-PCR检测50对乳腺浸润性癌和对应的正常组织中Nek2mRNA表达情况。利用原位杂交技术检测66例乳腺正常组织,66例导管内癌和66例乳腺浸润性导管癌中剪接异构体Nek2A mRNA的表达,并分析其与患者临床病理学特征的关系。在MCF10系列细胞系中检测Nek2及其剪接异构体Nek2A在代表乳腺癌不同发生阶段(乳腺正常细胞系MCF10A、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com和浸润性癌细胞系MCF10Cal)的表达差异,筛选出高表达和低表达的细胞系。利用基因转染技术,将Nek2A基因表达载体导入Nek2A低表达的乳腺正常增生细胞系MCF-10A,应用RT-PCR、Western blotting确认表达升高,利用SRB实验,流式细胞术和免疫荧光技术分别观察其对细胞增殖、细胞周期和中心体的影响,从而在细胞学水平上验证Nek2A基因的功能。为进一步研究Nek2A基因的分子作用机制,利用Nek2A-siRNA降低Nek2A在乳腺导管内癌细胞系MCF-10DCIS.com中的表达。应用RT-PCR、Western blotting确认Nek2A表达降低,利用SRB实验、流式细胞术荧光染料碘化丙啶、免疫细胞化学和免疫荧光技术分别观察其对细胞增殖、细胞周期和中心体的影响。TRIzol法提取沉默后的细胞总RNA,采用Affymetrix基因芯片技术分析基因表达谱,以筛选差异基因,并且利用real-time RT-PCR验证基因表达谱筛选的差异基因。结果1、Nek2表达与乳腺癌患者临床病理学指标的关系：Nek2蛋白表达在导管内癌和浸润性导管癌中表达比正常组织明显增高,Nek2在浸润性癌细胞质中的表达在不同组织学分级、不同肿物最大径和不同Ki67表达组间差异有统计学意义；Nek2在浸润性导管癌、伴发的导管内癌和纯的导管内癌细胞核中的表达分别是62/348(17.82%),28/137(20.44%),12/60(20.00%),同时检测Nek2mRNA表达,发现在浸润性癌组织显著高于正常组织。2、在导管内癌和乳腺浸润性导管癌组织中Nek2在细胞质中的表达与β-catenin在细胞质中的表达呈正相关,并且二者的表达均与Ki67的表达成正相关。这些结果提示Nek2可能通过调节中心体之间的连接成分之一β-catenin的变化调节中心体,从而在乳腺癌进展过程中发挥作用。3、观察比较代表乳腺癌不同病变阶段的人类乳腺癌发生模型MCF10细胞系(乳腺正常细胞系MCF10A、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com和浸润性癌细胞系MCF10Cal)和病人组织(包括乳腺正常、导管内癌和浸润性导管癌)中Nek2及Nek2A的表达和分布情况,发现Nek2和Nek2A在导管内癌和浸润性癌组织和细胞系中表达均明显增高。4、构建Nek2A的质粒并转染正常乳腺细胞系MCF-10A,发现增高Nek2A的表达导致MCF-10A细胞系中异常中心体的比例增高(Nek2A7.17±0.55%vs control1.93±0.3%,t=18.375, P<0.001)。5、合成特异的Nek2A-siRNA降低Nek2A在MCF-10DCIS.com(导管内癌)细胞系中的表达,检测到降低Nek2A表达可以使MCF-10DCIS.com细胞系增殖减慢并且导致细胞周期阻滞在G1/GO期,从而为临床治疗寻找新的分子靶标及为针对性个体化治疗提供线索。6、采用基因芯片技术分析Nek2剪接异构体Nek2A-SiRNA降低其表达的细胞系的基因表达谱,和对照组细胞系的基因表达谱比较,找出异常过表达和异常低表达基因,并且通过实时定量PCR验证基因芯片的结果,发现异常表达的基因多是与细胞增殖、细胞周期调控和细胞分化等与肿瘤发生发展密切相关的基因,为我们下一步研究提供了方向。结论我们的研究结果提示：Nek2及其剪接异构体Nek2A蛋白和mRNA表达在乳腺癌不同病变阶段中的差异可以为乳腺癌临床辅助诊断提供新指标,并且Nek2及其剪接异构体Nek2A可能作为潜在的乳腺癌治疗新靶点。