癫痫(epilepsy)是多种病因导致的慢性脑疾病,是大脑神经元过度放电引起阵发性、暂时性脑功能障碍的临床表现,是一种常见的中枢神经系统疾病。癫痫的发病率约为4-7‰,癫痫的临床分类有多种。全面性癫痫伴热性惊厥附加症(generalized epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+)是2001年国际抗癫痫联盟新命名的一种癫痫综合征。全面性癫痫伴热性惊厥附加症是临床上常见的、具有代表性的遗传性癫痫综合征,其临床特征为高热惊厥家系中的患儿在6岁以后仍有高热惊厥或伴有无热惊厥,或兼有其他发作形式的癫痫综合征。临床表现复杂,类型多种,频繁的癫痫发作严重地威胁到患者的生命,因此,寻找有效的诊断方法,探讨发病机制,对有效的控制癫痫发作有重要的价值。国外研究显示全面性癫痫伴热性惊厥附加症是常染色体显性遗传,具有显著的表型异质性和遗传异质性。同一个家系中受累成员的临床表型可不同,Scheffer首次报道GEFS+的大家族中,其核心家庭符合常染色体显性遗传,外显率为89%。Singh对9个GEFS+家庭的家系分析也表明为常染色体显性遗传,外显率约为50%-60%。由于有不完全外显率导致临床的各种表型及一些没有临床症状的被动携带者,Singh等主张以复杂性多基因遗传来解释GEFS+表型异质性的特性。GEFS+的发作形式具有丰富的异质性,是一种多形的家族性癫痫综合征,目前尚缺乏具体流行病学依据。最常见的表型是热性惊厥(febrile seizures,FS)；其次是热性惊厥附加症(febrile seizures plus, FS+)。GEFS+一般呈良性经过,智力运动发育正常,大多在25岁前或儿童后期停止发作。近年来,国外对GEFS+突变基因的研究取得了较大进展,发现多为离子通道编码基因突变所致,目前国外已报道了5个与GEFS+目关的基因—SCN1B(电压门控钠离子通道β1亚单位基因)、SCN1A(电压门控性钠通道α1亚基基因)、SCN2A(电压门控钠离子通道α2亚基基因)、GABR G2 (A型GABA受体γ亚基基因)和GABRD(A型GABA受体δ亚基基因)。(1)SCN1B突变与GEFS+:1998年Wallace等首先对—GEFS+大的澳大利亚家系进行连锁分析,发现一C121W的错义突变,Scheffer等在4个癫家系中发现了SCN1B突变,其中2个新的家系突变位点为原来已报道的(C121W),另外两个位点为R85C和R85H突变。(2)SCN1A突变与GEFS+:α亚单位编码的SCN1A是GEFS+最重要的基因。Annesi等对9个意大利GEFS+家系通过SSCP进行突变筛查,最后在其中两个家系中发现了2个SCN1A的异常突变,第一个突变是A2336G；第二个突变是T5522C。Spampanto等在对一GEFS+的意大利家系研究中证实了SCN1A的另一突变位点D1866Y,Audenaert等对一GEFS+家系进行连锁分析,把致病基因定位在2p24上。Pineda-Trujillo等对一GEFS+南美大家系的研究中发现G1742D的突变,Nagao等也报告了一GEFS+家系,在患者中发现了一SCN1A的错义突变(G5569T)。Barela等在一高加索GEFS+家系中又证明了SCN1A另一异常突变(R859C)。(3) SCN2A突变与GEFS+:Sugawara等在2001年首次对GEFS+患者中钠通道α2亚基编码的SCN2A进行筛查,发现一个在进化上非常保守的位点,即R187W突变,SCN2A的截断突变在一类似SMEI的难治性癫痫中得到证实。(4)GABAA突变与GEFS+:Baulac等在一个类似GEFS+的家系中,发现γ2亚单位的一个突变(K289M)。Wallace等在一个有儿童失神性癫痫和热性惊厥的家系中发现γ2亚单位另一突变(R43Q)。2006年,GEFS+家系中又有2个新的位点被发现,即E177A和R220H。2004年,Dibbens等在一澳大利亚家系中发现GABRD突变,该突变编码GABAA受体δ亚单位。黄希顺等收集到的7个GEFS+家系对GABRA6进行筛查,未发现相关突变。Bonanni等收集了7个GEFS+家系,在其中4个家系中GABRG2基因编码区发现了单核苷酸的多态性,该研究证明了GEFS+的遗传和表型异质性。张守山等对一个GEFS+家系GABRB2编码区全部11个外显子进行测序分析,结果在患者GABRB2基因外显子2第133个碱基处发现一新的C/G多态性。此外Audenaert D等报道的1个比利时四代大家系发现一新定位在2p24,但其致病基因尚未明确。尽管目前遗传学研究已取得明显进展,但已知的GEFS+基因突变仅存在于少数家系中,大多数GEFS+家系的致病基因仍有待更多的发现。鉴于目前国内外对此病的研究状况,为进一步了解GEFS+的发病机制,本研究拟采用PCR产物直接测序法对9个家系共有109名成员的GABRG2及SCN1B基因的全部外显子进行突变筛查,寻找中国人群GEFS+的致病基因,探索GEFS+患者GABRG2及SCN1B基因是否有突变,阐明中国人群GEFS+发病的分子机制。[对象和方法]1.对象：9例先证者于2002年1月至2009年12月期间就诊于广东省人民医院儿科癫痫专科门诊,均为汉族,全部来自广东。9例先证者按照2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)对癫痫及癫痫综合症分类诊断标准被确认为GEFS+后,我们采用统一制定咨询表格,通过门诊和家庭访视等方式对家系成员调查访问,严格按照国家法规取得患者及家属同意后,完善临床资料收集和抽取血样。收集到9个家系共109名成员接受调查(4名已过世,病史由亲属提供),抽取到血液样本105例。对照组：在本院体检中心随机选取健康人200例纳入对照组,均为汉族,性别、年龄均与患者组相匹配,各项检查均未见异常。2.临床资料收集：全部患者均完善视频长程脑电图、头部MRI检查,建立GEFS+病人资料库,制定和采用统一的调查表和方法,进行家系调查、资料收集和处理。3. GABRG2及SCN1B基因突变筛查：(1)全部家系成员(共105例)及200例健康对照人群均抽取200 ul外周静脉血液,提取基因组DNA。(2)根据GABRG2及SCN1B基因组标准序列,设计扩增全部外显子的PCR引物,全部病例标本采用PCR特异性扩增GABRG2基因的1-9号及SCN1B基因的1-5号外显子片段。(3)对PCR产物进行纯化,采用ABI3730测序仪进行测序。应用Vector NTI 8.0分析软件分析测序结果,并与GenBank中的标准序列进行比对,确定可能的突变位点后,扩增200例健康对照组相关基因片断进行比对,确定新发现的突变点,除外基因的多态性。如确定为突变位点,则采用上述方法对先证者家族成员进行突变筛查。[结果]1.本研究里共收集9个家系共有109名成员接受调查(4名已过世,病史由亲属提供),结果发现癫痫患者40例,特发性全面性癫痫2例,不能明确分类者3例。符合GEFS+临床表型患者35例(死亡1例),其中男24例,女16例,男女比例为1.5：1；GEFS+患者中FS有22例(65.6%),为最常见发作类型,首次发病年龄5个月-3岁,终止发作年龄多为3-6岁,发作次数为1次至数次不等。FS+8例(18.8%),余下5例(15.6%)中各有2例分别为FS+伴局灶性发作、FS+伴失神发作和1例为FS+伴肌阵挛发作2.实验组共105例GEFS+家系成员(其中患者34例)全部顺利完成GABRG2及SCN1B基因突变筛查,结果显示在所有家系患者及家系成员中均未发现迄今已报道的GABRG2的3个热点突变(K289M、R43Q、Q351X)及SCN1B热点突变(C121W、I70_E74del、R85C、R85H)。3.在本研究全部105例GEFS+家系成员(其中患者34例)中发现GABRG2cDNA序列的第-14号核苷酸A缺失变异,该变异在起始密码前。4.在本研究家系Ⅰ的三代男性共5名成员中均发现SCN1B的杂合错义突变H223D,位于第3号外显子,该突变导致组氨酸被天门冬氨酸替代,随后的300例健康对照结果均显示阴性。[结论]1.本文收集的9个家系中,其临床表型以FS、FS+为主要类型,还包括少数FS+伴失神发作、FS+伴肌阵挛发作、FS+伴局灶性发作以及特发性全面性癫痫。充分体现了GEFS+的表型异质性。2.我们对所有105例GEFS+家系成员(其中患者34例)进行GABRG2及SCN1B基因的全部外显子的PCR扩增及测序工作,结果未发现已报道的GABRG2热点突变(K289M.R43Q.Q351X)及SCN1B热点突变(C121W、I70 E74del、R85C、R85H)。提示GABRG2很可能不是中国南粤地区GEFS+的主要致病基因。进一步证实了GEFS+具有明显的遗传异质性。3.在GEFS+的GABRG2cDNA序列上发现了编码区起始密码子前第-14号核苷酸A的缺失变异,该变异在本研究全部GEFS+患者及大部分健康对照者中均存在,我们认为该变异可能是我国人群高频出现的单核苷酸多肽,并非GEFS+致病的潜在因素。4.在本研究家系I的三代男性共5名成员中均发现SCN1B的杂合错义突变H223D,位于第3号外显子,该突变导致组氨酸被天门冬氨酸替代,这提示SCN1B很可能是中国南方人群GEFS+患者的致病基因,此结果未在国内外报道,很可能是中国南方人群GEFS+的新型遗传学病因。