第一部分肠粘膜固有层单个核细胞的提取及分析目的:肠粘膜固有层是肠道免疫细胞定居和发挥免疫功能的场所,建立有效的提取肠粘膜固有层单个核细胞(Lamina propria mononuclear cell,LPMC)的方法对分析研究肠道免疫细胞的功能是必要的。应用Liberase TM酶提取LPMC,并对不同浓度和同一浓度下不同时间点所提取的细胞进行分析,以确定提取LPMC的最佳方案,为后续实验奠定基础。方法:1、为探究提取LPMC的最佳的酶工作浓度和消化时间,设定四组浓度梯度:50μg/ml组、100μg/ml组、150μg/ml组和200μg/ml组对LPMC细胞进行提取,消化起始时间为15min,每间隔5min作为一个消化终止时间点。镜下观察分离细胞的形态并对细胞进行计数,确定每个浓度组的最佳消化时间。2、随后,每组在确定的最佳消化时间下,进行LPMC细胞提取,台盼蓝染色观察细胞形态并计算死亡细胞百分比,以确定酶工作的最适浓度。3、对所提取的LPMC细胞进行流式抗体标记,流式细胞仪分析LPMC细胞表面特异性抗原表达情况。同时,我们提取了相应粘膜组织患者的外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cell,PBMC)进行流式抗体标记,对二者进行对比分析,以确定提取细胞的免疫活性。结果:1、各组提取细胞数量最多时,消化时间依次为:50μg/ml组50min,100μg/ml40和45min,150μg/ml组25和30min,200μg/ml组20min。其中Liberase TM150μg/ml组在25和30min所获取的细胞数量明显多于其他三组(P<0.05)。2、每组在确定的最佳消化时间点终止消化反应,台盼蓝染色镜下观察发现,Liberase TM 150μg/ml组死亡细胞百分比显著低于其他三个浓度组(P<0.01),其他各组之间两两比较无统计学差异(P>0.05)。倒置显微镜下观察表明,在Liberase TM浓度为150μg/ml,消化时间25min时,细胞分散程度较好,粘连细胞的数量显著少于其他三组(P<0.05)。3、进一步对Liberase TM浓度为150μg/ml,消化时间25min时提取的LPMC细胞表型分析表明,固有层内的淋巴细胞、固有淋巴样细胞和巨噬细胞分群较好,Liberase TM酶对三类免疫细胞细胞表面抗原表达没有显著影响。结论:通过对提取的LPMC细胞的形态学观察鉴定和免疫细胞表面特异性抗原的检测,我们建立了提取LPMC的最佳实验流程。我们认为提取LPMC最适宜的条件为:Liberase TM浓度为150μg/ml,消化终止时间为25min。通过这部分实验研究,为后续实验的顺利进行提供了有力的保障。第二部分CD169~+肿瘤相关巨噬细胞在结直肠癌中的表达及功能研究目的:肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophage,TAM)已被证明在肿瘤免疫发挥着重要的作用,然而TAM对结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的免疫调控机制尚不完全清楚。利用免疫学、分子生物学和细胞学等实验技术,探究CD169~+TAM细胞在CRC患者外周血和肿瘤组织中的表达和分布情况,分析CD169~+TAM细胞与CRC患者临床指标的相关性,研究活化的CD169~+TAM细胞对CRC肿瘤免疫的调节作用。方法1、利用流式细胞技术,检测CD169在CRC患者外周血单核细胞和肿瘤组织内的TAM细胞表达情况,同时对CD14~+CD169~+单核巨噬细胞的亚型进行进一步检测分析,通过免疫荧光技术检测CD169~+TAM在CRC肿瘤组织内的分布情况。2、LPS~+PMA体外刺激活化CD14~+CD169~+单核巨噬细胞,流式细胞仪检测CD14~+CD169~+IL-10~+M2细胞和CD14~+CD169~+IL-12~+M1细胞在CRC患者外周血和肿瘤组织内的表达情况。3、提取肿瘤组织内总RNA,分别对CD169、IL-4、IL-10、IL-12和IL-13m RNA相对表达量进行检测,ELIAS检测CRC患者和健康对照血清CD169~+TAM相关细胞因子的水平。4、依据TNM分期体系,对CRC患者进行分层分析,研究CD14~+CD169~+TAM细胞在早期和晚期CRC患者体内的分布情况。同时,对CD14~+CD169~+细胞与血清CEA水平的相关性进行分析,探究CD14~+CD169~+细胞与临床指标的关联性。5、对晚期CRC术后化疗患者进行随访,研究术后化疗对CD14~+CD169~+细胞数量的影响。结果:1、结果表明,CD14~+CD169~+TAM细胞在CRC患者外周血和肿瘤组织内表达明显增多,对CD169~+TAM细胞亚群研究分析发现,CD14~+CD169~+CD163~+和CD14~+CD169~+CD206~+M2型细胞数量在CRC患者中显著升高。免疫荧光结果表明,CD14~+CD169~+TAM细胞在肿瘤间质内浸润明显增加。2、体外刺激活化CD14~+CD169~+TAM细胞发现,CD14~+CD169~+IL-10~+M2细胞百分比明显增加,活化的CD169~+TAM细胞大量分泌IL-10。外周血和组织内CD169~+TAM细胞比例与血清IL-10水平呈正相关。3、对肿瘤组织内的m RNA检测发现,与M2细胞相关的细胞因子IL-4、IL-10和IL-13 m RNA相对表达水平也呈现上升趋势,并且CD169 m RNA相对表达水平与IL-4、IL-10和IL-13呈现明显正相关性。4、依据TNM分期对CRC患者分层分析表明,晚期患者外周血和组织内的CD169~+TAM细胞的数量与早期患者相比显著升高,无论早期或晚期CRC,外周血CD169~+细胞数量和肿瘤组织内的CD169~+细胞数量呈现正相关性,表明CD169~+TAM向组织内浸润的特征。另外,CRC患者外周血和肿瘤组织内的CD169~+细胞比例与血清CEA水平呈现出正相关性。5、对晚期术后化疗患者随访结果表明,随着化疗的进行,CD169~+TAM细胞比例逐渐恢复到正常人体内的水平。结论:我们的研究表明,CD169~+TAM细胞在CRC患者体内向着M2型细胞分化,抑制机体对肿瘤的免疫应答;动态监测患者外周血和肿瘤组织内的CD169~+TAM细胞对监测肿瘤复发和评估预后具有潜在价值。