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目的:Scleraxis修饰的hAMSCs能否与人脱细胞羊膜支架(HAAM)复合,并在此基础上验证Scx-hAMSCs-HAAM复合体的生物相容性及免疫原性。方法:1)取人足月剖宫产胎盘的羊膜组织,分别利用酶消法、冻融法制备人脱细胞羊膜支架(HAAM),将两种方法制备好的HAAM进行脱水、石蜡包埋、切片行HE染色后于倒置显微镜下观察,比较不同方法制备HAAM的形态学表现,评估两种方法脱细胞的效果。通过免疫荧光染色,将HAAM置于荧光显微镜下观察细胞移除的情况及经脱细胞处理后人羊膜表面细胞外基质(ECM)丢失的情况。2)同上方法获取人羊膜,经胰酶和胶原酶消化分离得到hAMSCs,纯化、培养、传代,倒置显微镜观察镜下hAMSCs生长及排列的情况,至P3代运用流式细胞术对hAMSCs行表型鉴定,CCK-8检测细胞增殖活性。构建Scx慢病毒载体,通过293T细胞对病毒进行扩增及滴度测定。选取合适滴度转染P3代hAMSCs获得Scx-hAMSCs,利用PCR、Western Blot技术检测Scx基因经转染后在细胞内的表达情况,CCK-8检测转染后细胞活性。3)将Scx-hAMSCs与HAAM共培养,在培养14d时对Scx-hAMSCs细胞进行活细胞染色检测其在HAAM上的生长分布情况,并分别于倒置相差显微镜、扫描电镜(SEM)下观察细胞形态学表现。然后设置空白对照组、阴性对照组、实验组三个分组,将已经制备的HAAM-Scx-hAMSCs置入SD大鼠背部筋膜下,观察一周后处死SD大鼠,取术区组织做HE染色,石蜡包埋、切片,镜下观察各组的免疫排斥反应。结果:1)制备人脱细胞羊膜支架(HAAM)酶消法脱细胞效果比冻融法好,经酶消法脱细胞后HAAM经HE染色可见组织表面光滑,已无法看到任何细胞结构,经免疫荧光染色,可见经酶消法处理后的HAAM细胞表达为阴性,且较脱细胞前的人羊膜(HAM)胶原无明显减少。2)采用胰酶+胶原酶消化HAM可获得大量稳定增殖的hAMSCs,经纯化、培养、传代后细胞形态逐渐呈纺梭形、细胞排列逐渐致密并呈现出螺旋式生长,流式细胞术鉴定P3代hAMSCs后提示间充质干细胞表面标志物CD73(92.1%)、CD105(84.8%)、CD90(94.7%)、CD44(94.1%)高表达,CD19+CD34+CD11b+CD45+HLA-DR(0.3%)呈阴性表达。酶切产物PCR检测在600bp位置显示条带大小,设置不同梯度对293T细胞进行转染,筛选出2×108TU/μL病毒原液,以6μL病毒原液转染P3代hAMSCs,分别于24h、48h后荧光显微镜下观察到细胞中大量荧光表达,提示转染效果良好,PCR检测Scx-hAMSCs转染组Scx基因表达量高于未转染组(*P<0.05)。3)将上步骤中制备的Scx-hAMSCs与HAAM进行细胞-支架复合,培养14天后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察经种植后Scx-hAMSCs已经覆盖HAAM,呈杆形或者纺锤形。HE染色可见相较于阴性对照组,置入Scx-hAMSCs-HAAM(实验组)局部术后1周后术区存在炎症反应,可见浆细胞和中性粒细胞浸润,组织局部可见肉芽组织、新生毛细血管生长,坏死和瘢痕修复并存,炎症反应较阴性对照组重;术后1个月,阴性对照组与实验组,在镜下呈现出炎症消退,实验组可见淡粉色疏松的类似于羊膜的被覆上皮组织包绕局部组织,且已出现细胞贴附生长,表层细胞呈线性紧密排列,可认为细胞-支架复合体植入SD大鼠体内后免疫原性较低。结论:1)利用酶消法处理人羊膜可以获得具有丰富的细胞外基质和良好孔隙率的人脱细胞羊膜支架(HAAM),可作为生物支架为种子细胞的生长繁殖提供条件。2)Scx-hAMSCs-HAAM与HAAM在动物体中短期时间内表现出低免疫原性,有助于组织工程韧带的构建,为其提供了潜在的移植物来源。