论文部分内容阅读
第一部分mi R-223-3p在体外内皮细胞损伤中的表达研究目的:不同浓度、不同时间的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)体外刺激人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),观察LPS所致内皮细胞损伤,并初步探讨mi R-223-3p与内皮细胞损伤的相关性。方法:LPS刺激浓度0ug/ml、1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用内皮细胞4天、5天、6天后,倒置光学显微镜下观察细胞形态的改变,并观察记录各浓度下细胞病变﹙cytopathic effect,CPE﹚的结果;运用Reed-Muench两氏法检测出半数细胞培养物感染量(Tissue culture infective dose,TCID50);采用WST-1法测定内皮细胞活性、评价内皮细胞生长;ELISA检测培养上清中炎症分子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达;采用实时定量PCR方法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术分别检测mi R-223-3p在培养上清及内皮细胞中的表达水平。结果:1、LPS可致内皮细胞形态发生改变,LPS刺激浓度越高,光镜下细胞发生病变越严重,可见细胞形态拉长,细胞间隙增大,有不同程度疏松贴壁,胞浆内颗粒减少,甚至部分细胞溶解、消失;LPS刺激浓度越高,WST-1检测细胞吸光度值(OD值)越低,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),随着刺激时间的延长,同一浓度LPS刺激组OD值呈降低趋势(P<0.0001)。2、ELISA法检测结果发现,随着LPS刺激浓度的升高,培养上清中TNF-α表达水平逐渐升高,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);随着LPS刺激浓度的升高,各LPS刺激组培养上清中IL-6水平较正常对照组均升高,差异具有统计学意义(P<0.01),刺激组组间差异具有统计学意义(F=63.6,P<0.01),两两比较发现,LPS 1ug/ml与LPS 20ug/ml、LPS 5ug/ml与LPS 10ug/ml两组差异无统计学意义,LPS 5ug/ml与LPS 10ug/ml两组培养上清中IL-6水平均高于LPS1ug/ml组,差异均具有统计学意义(P<0.0001)。3、RT-q PCR检测各LPS刺激组内皮细胞中mi R-223-3p相对表达量较正常对照组升高明显,差异具有统计学意义(P<0.05),但刺激组组间差异无统计学意义F=3.84,P=0.11)。在培养上清中mi R-223-3p相对无表达。结论:LPS对HUVEC损伤呈浓度与时间依赖性,随着LPS刺激浓度的升高,TNF-α浓度逐渐升高;各实验组IL-6浓度均较正常对照组升高,但并不随LPS刺激浓度的升高而增加。LPS刺激HUVEC构建细胞损伤模型构建成功。LPS刺激HUVECs后,细胞内mi R-223-3p表达水平上调,与LPS刺激浓度无相关性。第二部分mi R-223-3p在体外内皮细胞损伤模型中的作用机制研究目的:验证LPS刺激浓度与靶基因IL6ST的表达水平有无规律性;利用人工合成的LV-hsa-mi R-223-3p、LV-hsa-mi R-223-3p-inhibition慢病毒转染内皮细胞,进一步验证mi R-223-3p过表达、表达沉默时对HUVEC生长、上清中TNF-α、IL-6水平和细胞中靶基因IL6ST表达水平的影响。方法:RT-q PCR技术检测不同浓度LPS刺激HUVEC中靶基因IL6ST的表达水平;病毒转染部分实验分组为mi R-223-3p过表达组:mi R-223-3p过表达亚组(hsa-mi R-223-3p)、LPS刺激﹙刺激浓度取TCID50值﹚+mi R-223-3p过表达组(简写:LPS+mi R-223-3p);mi R-223-3p表达沉默组(hsa-mi R-223-3p inhibition);LPS刺激细胞组﹙LPS刺激组,取TCID50值﹚、正常细胞组、空慢病毒对照组(LV-control)。RT-q PCR法检测各组内皮细胞内IL6ST的表达水平;倒置荧光显微镜观察各组内皮细胞形态的改变;WST-1法检测细胞活性,ELISA检测上清中TNF-α、IL-6浓度。结果:1、LPS刺激浓度为1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用内皮细胞4天后,RT-q PCR检测各LPS刺激组IL6ST表达量较正常对照组升高明显,差异均具有统计学意义(P<0.05),但刺激组组间差异无统计学意义(F=1.5,P=0.27)。2、慢病毒转染人脐静脉内皮细胞24h内转染效率可达90%以上。3、病毒转染部分结果:(1)hsa-mi R-223-3p组:hsa-mi R-223-3p组细胞内IL6ST表达量较正常细胞组、LV-control组下调,差异均具有统计学意义(P<0.05),正常细胞组、LV-control组两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光镜下hsa-mi R-223-3p组细胞、LV-control组与正常细胞组相比较,均表现为15%-20%细胞轮廓不饱满,形态尚正常,细胞间隙无增宽,胞浆颗粒无减少,hsa-mi R-223-3p组细胞与LV-control组细胞形态无明显差异。WST-1检测hsa-mi R-223-3p组、LV-control组OD值较正常细胞组低,差异有统计学意义(P<0.05);hsa-mi R-223-3p组、LV-control组差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测hsa-mi R-223-3p组、LV-control组上清中TNF-α、IL-6水平较正常细胞组升高,差异有统计学意义(P<0.05);hsa-mi R-223-3p组、LV-control组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)LPS+mi R-223-3p组:LPS+mi R-223-3p组细胞内IL6ST表达水平较LPS刺激组下调,LPS刺激组较病毒对照组上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光镜下LPS+mi R-223-3p组细胞发生形态病变较LPS刺激组减轻,细胞皱缩数目减少,疏松贴壁程度减轻,未见大片细胞融合、溶解、消失。WST-1检测LPS+mi R-223-3p组OD值较LPS刺激组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测LPS+mi R-223-3p组上清中TNF-α、IL-6水平较LPS刺激组降低,差异具有统计学意义(P<0.05),推测mi R-223-3p过表达后负向调控TNF-α、IL-6的表达。(3)hsa-mi R-223-3p inhibition组:hsa-mi R-223-3p inhibition组细胞内IL6ST表达量较正常细胞对照组、LV-control组上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。荧光镜下hsa-mi R-223-3p inhibition组与hsa-mi R-223-3p组、LV-control组细胞形态改变差异不明显,可见约15%-20%细胞轮廓不饱满,形态尚正常,细胞间隙无增宽,胞浆颗粒无减少。WST-1检测hsa-mi R-223-3p inhibition组OD值较正常细胞组低,差异有统计学意义(P<0.05);hsa-mi R-223-3p inhibition组、LV-control组差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测hsa-mi R-223-3p inhibition组上清中TNF-α、IL-6水平较正常细胞组升高,差异有统计学意义(P<0.05),hsa-mi R-223-3p inhibition组、LV-control组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)hsa-mi R-223-3p组与hsa-mi R-223-3p inhibition组相比较,细胞内IL6ST基因表达水平下调明显,差异有统计学意义(P<0.05),但荧光镜下细胞形态差异不明显,细胞活性、上清中TNF-α、IL-6水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1、LPS刺激HUVECs后,IL6ST表达水平上调,但不依赖于LPS刺激浓度。2、慢病毒转染HUVECs效率达90%以上,但病毒转染对HUVECs有一定程度的损伤作用。3、mi R-223-3p过表达可引起IL6ST基因表达下调;mi R-223-3p表达沉默可导致IL6ST基因表达上调。在LPS损伤模型中,mi R-223-3p可能通过抑制IL6ST基因过度表达来发挥保护作用。4、mi R-223-3p过表达后负向调控TNF-α、IL-6的表达,可减轻LPS刺激HUVECs造成的内皮损伤。